13а.Окраска по Гомори-Гроккоту в модификации В.С.Лесового(с.31)
-депарафинирование срезов
-5% трехокись хрома 30 мин при 37-40 град.С
-проточная вода 10 мин
-1% бисульфит натрия 1 мин
-проточная вода 5 мин
-3 смены дистиллированной воды по 2 мин в каждой
-импрегнация в растворе уротропин-серебра 30 мин при 56-58 град С
-3 смены дистиллированной воды по 2 мин каждая
-отбеливание в 1% растворе хлорамина или хлорной извести или НС1 10 мин под микроскопом или в разведенной пополам перекиси водорода
-докраска 0,05% растворе пикриновой кислоты в 70% спирте в течение 1 мин
-2% раствор гипосульфита натрия-2-5 мин
-проточная вода 5 мин
-обезвоживание,просветление,бальзам
ПРИГОТОВЛЕНИЕ уротропин-серебра:5 мл 5%-го раствора азотнокислого серебра смешивают с 3% раствором уротропина.Сначала образуется белый осадок,который исчезает при помешивании.Раствор становится прозрачным и бесцветным.Может сохраняться в течение 2-х недель при комнатной температуре и месяц в холодильнике
РЕЗУЛЬТАТ:грибы коричневого или черного цвета,фон бледно-желтый или бесцветный.
При этой методике коллагеновые волокна окрашиваются в коричневый,ретикулиновые-в черный цвет,при перекраске эритроциты могут стать темно-коричневыми и симулировать клетки грибов.
13б Окраска грибов по Граму-Вейгерту
-парафиновые срезы до воды
-окраска кристаллвиолетом по Хукеру и Конну-30 секунд(краска годна 2-3 года)
Готовят:2 г кристалл.фиолетового,+20 мл 96 % спирта,+800 мг щавелево-
кислого аммония,80 мл дистиллированной воды
-окунуть в воду-обработать йодом по Вейгерту 20-30 сек(2 г йодистого калия растворить в 2-3 мл дистиллированной воды.Затем добавить 1,0 г кристаллического йода,долить до 100 мл)
-дифференцировать в ацетоне 10-15 сек
-промыть в воде
-докрасить 0,5% водным сафранином 30 сек
-дифференцировать и обезводить в ацетоне,добавляя его по каплям -10-15 сек
-просветлить в смеси ацетона с ксилолом,двух сменах ксилола.Заключить в полистирол?
РЕЗУЛЬТАТЫ:грамположительные грибы сине-черные,грамотрицательные и фибрин-красного цвета,цитоплазма-розовая
13в.Окраска по А.А.Боголепову (с.25)
-срезы окрашивают в свежеприготовленном водном растворе эозина 2-3 мин(насыщенный спиртовый раствор эозина 5 мл,вода дистил.95 мл)
-слить краску,не споласкивая в воде,просушивают фильтровальной бумагой
-окрашивают карболовым генциановым фиолетовым(через фильтровальную бумагу) 5 мин(раствор готовят из расчета 5 капель насыщенного спиртового раствора краски на
1 мл 2,5% карболовой воды.Краска годна после суточного стояния не более 6 суток)
-р-р Люголя 2-3 мин,обсушивание фильтровальной бумагой,дифференцировка в анилин-ксилоле(готовят из расчета:1 часть анилинового масла,2 части ксилола)
-ксилол,бальзам
РЕЗУЛЬТАТЫ:грамположительные грибы окрашиваются в темно-синий цвет.Грибы должны быть "свежими"(их гибель ухудшает качество окрашивания)
Лучшие результаты дает окраска по Граму,применяя не кармин,а сновной фуксин,приготовленный Гудпастуру.
13г.Окраска по Граму с красителем Гудпастура(методика,предложенная Мак-Коллюмом)
-окрашиваются срезы 10-30 мин в красителе Гудпастура(фуксин основной 0,59 г,аналин 1 мл,фенол кристаллический 1 г,спирт 30% 100 мл) и затем промывают водой.
-обрабатываются в крепком формалине в течение нескольких секунд(до появления розового цвета вместо красного),после чего снова промывают в воде.
-окрашивают в насыщенном растворе пикриновой кислоты в течение 2-5 минут,пока срезы не примут фиолетово-желтый цвета и снова промывают в воде.
-дифференцируют в 96% спирте(до восстановления красного цвета),опять промывают в воде.
-окрашивают в растворе кристаллического фиолетового или генцианового фиолетового в течение 5 минут(краски 5 г,абсолютный спирт 10 мл,аналин 2 мл,вода 88 мл),промывают в воде.
-погружают в йодистый раствор Грама на 1 мин(1 г йода кристалл,йодистого калия 2 г,дистилл.воды 300 мл)
-высушивают фильтровальной бумагой
-обрабатывают в равных частях анилина и ксилола до прекращения изменения цвета
-промывают 2 раза ксилолом и заключают в бальзам.
РЕЗУЛЬТАТЫ-грамположительные элементы гриба окрашиваются в голубой цвет,грамотрицательные-в красный.Тканевые элементы-от красного до пурпурного.
Общий недостаток этих окрасок-неспецифическое прокрашивание тканей,которые могут быть приняты за грибы.Хорошо красятся молодые формы грибов,отмирающие плохо.
Плесневые не окрашиваются вообще.
Следующие методы лишены указанных недостатков.
13д.Окраска по Брауну-Брен в модификации Хмельницкого
-срезы окрашивают железным гематоксилином Вейгерта в течение 2-4 мин,после чего ополаскивают вследствие из-за обильного отхождения краски
-дифференцируют в 1% растворе соляной кислоты и помещают в воду на 3 мин
-окрашивают карболовым генциановым фиолетовым 5-10 мин(в маленькой бутылочке смешивают 5 капель 5% бикарбоната настрия,содержащего,соедержащего 0,5% фенола для предотвращения гниения с 0,75 1% водного р-ра генцианового фиолетового,который смывают водой)
-красят срезы раствором Люголя 1 мин,после чего обмывают спиртом и дифференцируют срез в растворе анилина со спиртом(1 часть анилинового масла и 1 часть 96% спирта),пока не перестанет отходить краска
-смывают раствор анилина 96% спиртом и промывают срез в воде
-окрашивают очень быстро освновным фкусином(5 мл насыщенного спиртового р-ра основного фуксина на 100 мл дистиллированной воды),смывают 96% спиртом и дифференцируют 1% спиртовым р-ром пикриновой кислоты до тех пор,пока не перестанет отходить краска
-переносят последовательно срез в 96% спирт,в смесь 96: спирта с ксилолом(пополам),затем в чистый ксилол,после чего заключают в бальзам
РЕЗУЛЬТАТЫ:ядра клеток окрашиваются в черно-коричневый цвет,цитроплазма-
в желтый,Грамположительные грибы окрашиваются в сине-лиловый,грамотрицательные-
в красно-лиловый.
Достаточно хорошо выявляются грибы по методу Шабадаша в модификации Цинзерлинга(см ШИК-реакцию)
13е Более достоверно выявляются грибы методом Гридли
-срезы опускаются на 1 час в 4% хромовую кислоту,после чего промываются 5 мин в проточной воде
-погружают в реактив Фельгена,приготовленный по Колеману(раствор 1 г основного фуксина в 200 мл кипяченой воды),отфильтровывают и прибавляют 2 г метабисульфита калия и 10 мл нормального раствора соляной кислоты.Дают обесцветиться сутки,затем прибавляют 0,5 г активированного угля,встряхивают и фильтруют через бумагу.Р-р должен быть бесцветным
-ополаскивают в сернистой кислоте три раза по 2 мин(10% метабисульфит настрия 6 мл,нормальной серной к-ты 5 мл,дистиллированной воды 100 мл) и после этого промывают в проточной воде
-кладут срезы на 15-20 минут в альдегидно-фуксиновый раствор(фуксин основной 1 г,70% спирт 200 г,паральдегид 2 мл,соляная кислота 2 мл.Приготовленный р-р зреет три дня и должен быть синего цвета
-смывают избыток краски 96% спиртом и промывают срезы в воде
-подкрашивают метанилом желтым в течение 2-5 мин(метанил желтый 0,25 г,ледяная уксусная к-та 0,25 г,дистиллир.вода 100 мл)
-промывают срезы в воде,обезвоживают и заключают в бальзам
РЕЗУЛЬТАТЫ:нити темно-голубые,споры от темно-розового до пурпурного,общий фон желтый.МЕТАНИЛ ЖЕЛТЫЙ МОЖНО ЗАМЕНИТЬ ПИКРИНОВОЙ КИСЛОТОЙ
(срезы красятся 1 минуту в 0,05% растворе ее в 70% спирте)
Последние 2 метода позволяют выявить и молодые,и старые формы грибов.Параллельно
необходимо красить срезы гематоксилином и эозином)т.к неспецифически окрашиваются тканевые струткры,имитируя грибы.
13ж.Метод сульфатирования.
Позволяет выявить очень молодые формы грибов,не всегда обнаруживаемые другими методами(напр,кокцидиоидоз)
-срезы после удаления парафина помещают в абсолютный спирт на 5 минут и высушивают в воздухе 5 минут.
-помещают в сульфатирующий реактив на 5 минут
-срезы кладут на 3 мин в 3% уксусную кислоту и окрашивают 0,01% раствором толуидинового синего в 3% уксусной кислоте 5 мин
-просмывание в 3% уксусной кислоте 1 мин
-помещают срезы последовательно на 1 мин в 96 спирт,ксилол,полистирол
СУЛЬФАТИРУЮЩИЙ РЕАКТИВ получается при смешивании один к одному концентрированной серной кислоты с предварительно замороженным диэтиловым эфиром.Серная кислота также должна быть охлаждена
