Метод широко применим в бактериологии для разделения всех видов бактериальной флоры на грамположительную и грамотрицательную.В патологической анатомии метод имеет дополнительное значение ввиду того,что тинкториальные свойства микрофлоры
меняются на противоположные ввиду посмертных изменений.
4а.Окраски по Граму и Граму-Вейгерту.
-срез поместить в раствор анилинового фиолетового(1 мл анилина и 10 мл дистиллированной воды взболтать в пробирке 1-2 мин,профильтровать через влажный фильтр,к прозрачному фильтрату добавить 1 мл насыщенного(примено 10%-го или,что хуже,генцианового фиолетового или метилового фиолетового(приготовленная краска сохраняется около 10 суток,а насыщенный раствор-неограниченно долго)-на 2-5 минут
-краску слить
-сполоснуть водой
-налить раствор Люголя(1 г йода+2 г йодистого калия+300 мл дистиллированной воды)-до почернения,около 1 мин
-хорошо,но быстро просушить фильтровальной бумагой
-дифференцировать-удалить избыток красителя 96% этанолом(при окраске по Граму),анилином(при окраске по Граму-Вейгерту),смесью анилина и ксилола(в соотношении 1:1) для меньшей скорости обесцвечивания или по модификации автора с дифференцировкой вначале 96% этанолом(на препарат налить 2-5 капель и быстро слить,а затем анилин-ксилолом.).
Преимущество последнего способа дифференцировки в том,что микроорганизмы окрашиваются интенсивнее(грамположительная флора делается почти черной),
фибрин же окрашивается почти также,как при методике Грама-Вейгерта.Дифференцировку проводить до прекращения отхождения синеватых полос из извлекаемой краски при покачивании стекла
-хорошо промыть ксилолом,повторно наливая его на стекло(иначе через несколько суток бальзам начнет окрашиваться в интенсивно-желтый цвет,сам же срез постепенно обесцвечивается)
-заключить в бальзам.
Далее обычно производится дополнительная окраска тканей. Для этого срез окрашивают:
а)после окраски анилиновым фиолетовым раствором кармина по Гренхагеру
(3-5 г аммиачных или калийных квасцов растворить в 100 мл дистиллированной воды+
1 г кармина,кипятить 1 час,после охлаждения профильтровать и добавить 1 мл 40% формалина)- на 2-24 часа или литиевого по Орту(2-5 г кармина всыпать в 100 мл насыщенного-около 1,5%-го водного раствора углекислого лития,прокипятить,после
охлаждения профильтровать)- на 5-10 мин.При загрязнении растворов кармина,в частности,из-за размножения в них грибов,эти р-ры можно применять после кипячения с последующим фильтрованием.
РЕЗУЛЬТАТЫ:Ядра клеток красноватые,иногда с синеватым оттенком,цитоплазма светлая или серовато-синеватая.Грамположительная флора темно- синяя,грамотрицательная-при докраске раствором карболового фуксина-красная.При докраске раствором кармина-сероватая.Критерием полноценности выявления грамположительной микрофлоры при окраске по Граму-Вейгерту является отчетливое выявление фибрина,что целесообразно учитывать при контроле за ходом дифференцировки.
4б Окраска по Браун-Брену(в модификации О.К.Хмельницкого)
-срез поместить в железный гематоксилин Вейгерта на 2-4 мин
-прополоснуть в воде
-дифференцировать в 1% р-ре соляной кислоты
-поместить в воду на 3 мин
-окрасить карболовым анилиновым фиолетовым(в маленькой бутылочке смешать 5 капель 5%-го бикарбоната натрия,содержащего 0,5% фенола+ 0,75 мл 1%-го водного
раствора анилинового фиолетового)-5-10 мин
-смыть водой
-налить р-р Люголя на 1 мин
-смыть в 96% этанолом
-дифференцировать в смеси анилина и 96% этанола(1:1)
-смыть 96% этанол-промыть водой-окрасить очень быстро раствором основного фуксина(5 мл НСРФ+ 100 мл дистиллированной вроды
-смыть 96% этанол
-дифференцировать 1% спиртовым раствором пикриновой кислоты до тех пор,пока не перестанет отходить краска
-заключить в бальзам
РЕЗУЛЬТАТЫ:ядра клеток окрашиваются в черно-коричневый цвета,цитоплазма -
в желтый.Грампложительные грибы и бактерии окрашиваются в сине-лиловый,почти черный цвет,грамотрицательные-в красно-лиловый.
