Лекции.Орг


Поиск:




Категории:

Астрономия
Биология
География
Другие языки
Интернет
Информатика
История
Культура
Литература
Логика
Математика
Медицина
Механика
Охрана труда
Педагогика
Политика
Право
Психология
Религия
Риторика
Социология
Спорт
Строительство
Технология
Транспорт
Физика
Философия
Финансы
Химия
Экология
Экономика
Электроника

 

 

 

 


Окраска с использованием фуксинсернистой кислоты(ШИК-реакции)




Принцип метода:образование соединений фуксинсернистой кислоты с альдегидными группами соединений лилово-красного цвета.Последние возникают при окраске простейших и грибов.Лучше применять периодат калия(окраска по Шабадашу)

Окраска по Шабадашу.

-срез промыть дистиллированной водой

-поместить в р-р перйодата(400 мг йоднокислого калия или натрия+10 мл 0,2 нормального р-ра уксусной к-ты,на дне остается осадок)-на 5-10 мин

-сполоснуть в дистиллированной воде 3-10 мин

-пломестить в фуксинсернистую кислоту(! г чистого основого фуксина для фуксинсернистой кислоты,растертого в ступке до мелкого порошка,залить 210 мл кипящей дистиллированной воды,после взбалтывания в течение 5 мин остудить до 60-70 град С,затем профильтровать через фильтровальную бумагу,охладить до 50 град С,затем добавить 20 мл 1 нормальной соляной кислоты,охладить до 20-25 град С,добавить 1 г метабисульфита калия илои безводного бисульфита натрия.Раствор,вначале рубиново-красный,постепенно обесцвечивается,до полного обесцвечивания его держать плотно закрытым в темном прохладном месте от 12 час до 3 сут,фуксинсернистой кислотой можно пользоваться повторно,если она остается бесцветной--на 10-30 мин

-промыть в дистиллированной воде

-хорошо промыть в сернистой воде(200 мл водопроводной воды+10 мл 10%-го метабисульфита натрия+10 мл 1 норм.соляной кислоты,сернистой водой можно пользоваться повторно при хранении ее в плотно закрытой посуде.

-окрасить гематоксилином,напр.,Гарриса,с последующей дифференцировокой 1% водным раствором соляной кислоты и промывкой в щелочной воде до восстановления синеватой окраски ядер

-заключить в бальзам

РЕЗУЛЬТАТЫ:Препараты,окрашенныве по данной методике,напоминают окрашенные гематоксилином и эозином.Ядра клеток темного синевато-серого цвета,цитоплазма бледно-фиолетовая.Микоплазмы,грибы рода кандида,пневмоцисты,токсоплазмы,слизь,окрашиваются в красно-фиолетовый цвета,плесневые грибы,некапсулированные бактерии окрашиваются только гематоксилином.

 

8 Методы выявления НВ антигена

8а Окраска орсеином.

Данная окраска имеет наибольшее значение для диагностики гепатита В

Окраска по Шиката.

-срез поместить в 1-й раствор(9,5 мл 5%-го марганцовокислого калия+5 мл 3%-го раствора серной кислоты+85 мл дистиллировавнной воды)-на 10 мин

-поместить в 2% щавелевую кислоту на 10 мин

-промыть в проточной воде 5 мин,затем в двух порциях дистиллированной воды и двух порциях 70%-го этанола

-на срез налить краситель(орсеин 4 г,70% этанол-100 мл,концентрированной соляной кислоты-2 мл)-на 4 часа

-промыть в проточной воде 10 мин

-дифференцировать солянокислым этанолом

-заключить в бальзам

РЕЗУЛЬТАТ:в цитоплазме гепатоцитов на светло-коричневом фоне тканевых элементов выявляются крупные округлые темно-коричневые включения однородного строения.Аналогично окрашиваются ядра лимфоцитов в перипортальных инфильтратах

Эластические волокна,медно-белковые комплексы окрашиваются также в коричневый цвет.

Рез-ты во многом определяются качеством красителя.Встречаются реактивы,не окрашивающие специфический субстрат.Поэтому при смере реактива необходимо апробировать его на материале,где уже был получен положительный результат.

Редко реактив пригоден более 2 недель,поэтому нужен свежий.Но все же встречаются орсеины,окрашивающие цитоплазму гепатоцитов диффузно,особенно на секционном материале.Поэтому предложены другие методы.

 

 

8б Окраска резорцин-фуксином(по Сенба,1982 г):

(А.С.Логинов, Аруин Л.И.Клиническая морфология печени.М.,Медицина,1985 г,с.12)

1.Фиксация в 10% формалине,заливка в парафин

2.Обработка депарафинированных срезов течение 10 мин в смеси,содержащей из 5% перманганата калия(9,5 мл),3% серной кислоты(5 мл),дистиллированной воды до 100 мл

3.Обесцвечивание срезов в течение 10 мин в 2% щавелевой кислоте

4.Промывка в проточной воде

5.Сенсибилизация(в 2% железо-аммонийных квасцах или в 1% нитрате уранила)

6.Помещение срезов на 1-3 часа в раствор резорцин-фуксина.

Приготовление раствора:

К 200 мл 1% раствора основного фуксина добавляют 5 г резорцина.Раствор кипятят в широкой чашке(диаметром 25 см) при постоянном перемешивании примерно 30 мин

(пока объем не уменьшится вдвое),затем добавляют 25 мл 29% раствора хлорида железа

и кипятят еще 5 мин.Охлажденный раствор фильтруют и осадок промывают на том же фильтре дистиллированной водой до тех пор,пока вода не перестанет окрашиваться.

Осадок вместе с фильтром заливают 200 мл абсолютного спирта и кипятят в водяной бане 2-5 мин,восстанавливают объем испарившегося абсолютного спирта(до 200 мл)

и добавляют 4 мл НС1.Дифференцируют окрашенные срезы абсолютным спиртом,

затем 1% солянокислым спиртом 5 мин.После этого промыввают в воде,обезвоживают

и заключают в бальзам.

РЕЗУЛЬТАТЫ:НВ антиген,эластические волокна,желчные пигменты темно-синие или черные.

 

8в Высокоспецифичный метод для выявления НВ антигена по(,1982 г).

1.Депарафинированные и доведенные до воды срезы обрабатывают метанолом,содержащим 0,6% перекиси водорода,в течение 20 мин для подавления эндогенной пероксидазы.

2.Промывают в трех сменах фосфатного буфера(рН 7,2)

3.Инкубируют в растворе пероксидазы(5 мг на 100 мл),нанесенном на срезы,в течение

 

30 мин при комнатной температуре во влажной камере

4.Промывают в буфере

5.Обрабатывают диаминобензидином

6.Промывают в буфере

7.Докрашивают ядра гематоксилином Майера

РЕЗУЛЬТАТЫ:включения НВ антигена темно-коричневого цвета

 

 

9 Импрегнация азотнокислым серебром.

Для выявления бактериальной флоры с успехом может быть применена импрегнация серебром,что может осуществиться как в тканях,так и в срезах.

9а Импрегнация по Левадити:

-кусочки тканей после фиксации хорошо промывают в воде-не менее 1 суток

-поместить в 96% этанол на 1 сут

-перенести в дистиллированную воду до удаления этанола(до тех пор,пока кусочки не потонут,но не более 1 сут)

-поместить в 2-3% р-р азотнокислого серебра в темной,наглухо закрытой банке при температуре 37 град С на 3-4 суток

-быстро сполоснуть в растворе пирогалловой кислоты(3-4 г+95 мл дистиллированной воды+5 мл 40%-го раствора формалина).затем положить в него при комнатной температуре на 1 сут

-промыть в воде

-залить в парафин

-приготовить срезы и заключить в бальзам

РЕЗУЛЬТАТЫ:ткань окрашивается в желто-коричневый цвета,бактерии-в черный

 

 

9б Импрегнация по Вартину-Старри:

-срез поместить в подкисленную воду(рН 3,8-4,4 бидистиллированная вода или кипяченая дистиллированная вода подкисляется 1% раствором лимонной кислоты)

-поместить в 1% раствор азотнокислого серебра в стаканчике,обернутом черной бумагой и предварительно подогретом до 43 град С,перенести в водяную баню или термостат при температуре 43 град на 30 мин

-срезы положить на стеклянные палочки и покрыть проявителем(готовится непосредственно перед употреблением в маленьком стаканчике,при сливании помешивается стеклянной палочкой предварительно нагретые в термостате до 56 град С 4 мл 2%-го раствора азотнокислого серебра+10 мл 5%-го желатина+5,4 мл 0,15% раствора гидрохинона),проявить в термостате при 56 град С без доступа света 5-12 мин(до приобретения срезов золотисто-коричневого или золотисто-желтого цвета)

-быстро и тщательно ополоснуть в подогретой до 56 град С водопроводной воде

-обезводить в этаноле восходящей крепости(70,96 и 100%0-по 15 мин

-заключить в бальзам.

РЕЗУЛЬТАТ:на желтом фоне выявляются черные бактерии

 

 

9в Импрегнация в срезах с докраской по Семенович(с докраской гематоксилином и эозином)

-срез поместить в 0,008 М ацетатного буфера с рН 3,6-соединить 18,5 мл 0,2 М уксусной кислоты(1,2 г кислоты растворить в 100 мл дистиллированной воды)+1,5 мл 0,2 М ацетата натрия(1,64 ацетата натрия растворить в 100 мл дистиллированной воды)+500 мл кипяченой дистиллированной воды-на 2 мин

-поместить в 1% раствор азотнокислого серебра в темной посуде при 56 град С-на 30 мин

 

-срез положить на стеклянные палочки и покрыть проявителем(15 мл 5%-го желатина+3 мл 2%-го азотнокислого серебра+1 мл 3%-го гидрохинона,при сливании помешивать стеклянной палочкой) при температуре 37 град С-10 мин

-промыть в двух порциях теплого ацетатного буферного раствора

-поместить в 5% раствор тиосульфата натрия

-промыть в дистиллированной воде 5 минут

-окрасить гематоксилином и эозином

-заключить в бальзам

РЕЗУЛЬТАТЫ:бактерии окрашиваются в черный цвета,ткани окрашены гематоксилином и эозином,но с желтоватым оттенком цитоплазмы и волоконистых структур

 





Поделиться с друзьями:


Дата добавления: 2015-09-20; Мы поможем в написании ваших работ!; просмотров: 1062 | Нарушение авторских прав


Поиск на сайте:

Лучшие изречения:

Надо любить жизнь больше, чем смысл жизни. © Федор Достоевский
==> читать все изречения...

2401 - | 2073 -


© 2015-2025 lektsii.org - Контакты - Последнее добавление

Ген: 0.01 с.