Метод определения гиалуронидазы
Готовится гиалуроновая кислота из пупочных канатиков. Для этого свежие пупочные канатики очищаются от крови, разрезаются, освобождаются от сосудов, измельчаются ножницами, взвешиваются, заливаются двойным количеством воды и варятся до оседания кусочков на дно (до кипения не доводить). Раствор пропускают через марлевый фильтр. Фильтрат является гиалуроновой кислотой.
2-миллиардная взвесь суточной агаровой культуры бактерий разливается в пробирки, добавляется рабочее количество гиалуроновой кислоты. Объем жидкости доводят до 1 мл физратвором. Добавляется по 3 капли 15 %-й уксусной кислоты. Ингредиенты осторожно смешивают и учитывают результат.
С уксусной кислотой гиалуроновая кислота должна давать сгусток.
Если штамм продуцирует гиалуронидазу высокой активности, муциновый комочек образуется только в шестой пробирке (контроль). В опытных пробирках жидкость будет равномерно мутной. Если активность фермента невелика, то образование сгустка наблюдается только в первых 2 или 3 пробирках. При отрицательной реакции во всех пробирках образуются сгустки.
Задание 31. Определение нейраминидазной активности микробов:
- культуральную жидкость 72-часовой бульонной культуры синегнойной палочки залить по 0,2 мл в пробирки, добавить по 0,4 мл смеси овомуцина (яичный белок) пополам с фосфатным буфером 0,1 М рН 6,0;
- после одночасового инкубирования в термостате при t 37 °С в пробирки внести по 0,4 мл 4,0 %-го арсенита Na в 0,5 н растворе серной кислоты. Смесь встряхнуть до исчезновения желтой окраски;
- затем добавить по 0,3 мл 0,1 М раствора тиобарбитуровой кислоты, рН 9,0 и пробирки поместить в кипящую водяную баню на 5–7 мин, охладить на льду и в каждую из них внести по 5 мл бутанола;
- появляющееся интенсивное окрашивание смеси свидетельствует о наличии нейраминидазы;
- сделать заключение по заданию.
Задание 32. Определение проявления действия микробных токсинов:
- демонстрация и определение гемолитического действия, вызываемого стафилококками, стрептококками, кишечной палочкой на кровяном агаре;
- столбнячного, ботулинического экзотоксина на мышах (на таблицах и слайдах);
- сделать заключение по заданию.
Задание 33. Определение лизоцимной активности бактерий:
- взвесь миллиардной суточной культуры Micrococcus 0,2 мл засеить в слой 0,7 %-го питательного агара в чашке Петри;
- на поверхность подсушенного агара (с микрококком) петлей в виде бляшек нанести суточные культуры исследуемых штаммов. На одну чашку засеить до 9 исследуемых штаммов;
- посевы инкубировать в термостате в течение 24 ч при 37 °С;
- учесть наличие зон лизиса микрококка вокруг колонии исследуемой культуры с помощью бинокулярной лупы в мм;
- сделать заключение.
