Клонирование генов – это процедура, включающая выделение и амплификацию отдельных генов в реципиентных клетках, про- и эукариотических. Эти клетки, содержащие нужный ген, можно использовать для получения: а) большого количества белка, кодируемого данным геном; б) большого количества самого гена в высокоочищенном виде.
Процесс клонирования генов включает в себя несколько стадий:
1. Получение необходимого гена:
а) путем расщепления геномной ДНК с помощью рестриктаз (эндонуклеазы, расщепляющие молекулу ДНК в строго определенном месте);
б) путем химического синтеза только небольших фрагментов ДНК (так как зная последовательность аминокислотных остатков в белковой молекуле, можно всегда определить последовательность нуклеотидов в фрагменте ДНК, кодирующем данный белок, в соответствии с генетическим кодом). Так, путем химического синтеза был получен ген, ответственный за синтез соматостатина;
в) из клеток организма выделяют молекулы иРНК и с помощью фермента обратной транскриптазы (РНК-зависимая ДНК-по-лимераза) снимают ДНК-копии необходимого гена. Например, из островных клеток поджелудочной железы были выделены иРНК, несущие информацию о синтезе инсулина. А из клеток, инфицированных вирусами, выделены и РНК, несущие информацию о синтезе интерферона.
2. Ввод выделенного или полученного фрагмента ДНК в состав векторной молекулы ДНК – получение рекомбинантной ДНК. Вектор – это нечто вроде молекулярного «такси», способного переносить чужую ДНК внутрь бактериальной клетки таким образом, чтобы она могла там реплицироваться. Существует два основных типа векторов: бактериальные плазмиды (чаще ответственные за устойчивость к двум и более антибиотикам) и умеренные дефектные (способные к осуществлению трансдукции) бактериофаги.
Плазмиду расщепляют с помощью рестриктазы в сторого определенном месте. После расщепления ее концы, как и концы выделенной для клонирования ДНК, с помощью концевой трансферазы «доращивают» так, чтобы концевые участки плазмиды были комплементарны встраиваемой ДНК (или еще говорят «липкими»). Далее, благодаря взаимодействию «липких» последовательностей и с помощью специальных ферментов ДНК-лигаз осуществляют сшивку (лигирование) ДНК-вставки и плазмидной ДНК. Полученная в результате новая кольцевая молекула ДНК называется уже рекомбинантной ДНК.
3. Ввод рекомбинантной ДНК в состав клетки-реципиента. Клетки, выбранные для клонирования генов могут быть как про-, так и эукариотическими. Чаще всего для этой цели используют бактерии, поскольку их культивирование не представляет большой проблемы (E. coli, В. subtilis и др.). Но если ген выделен по методике 1, то его необходимо клонировать в клетках эукариотов, например, дрожжей. Ввод рекомбинантной ДНК осуществляют путем трансформации (проницаемость клеточной стенки бактерий увеличивается в разбавленном растворе хлористого кальция) или трансдукции (в случае использования в качестве вектора бактериофага).
4. Отбор трансформированных бактерий. Поскольку не все бактериальные клетки в реакционной смеси будут трансформированы, необходимо произвести отбор клеток, содержащих рекомбинантные бактерии. Отбор обычно основан на том, что плазмиды обеспечивают резистентность к тем или иным антибиотикам, а следовательно, бактерии, содержащие плазмиды, будут размножаться в присутствии соответствующего антибиотика.
5. Культивирование трансформированных клеток. Культивирование отобранных клеток необходимо для наращивания биомассы с целью амплификации генов в клетках-реципиентах.
6. Выделение белкового продукта гена или выделение встроенной ДНК из очищенных плазмид.
Получение моноклональных антител (МКА)
Основные методы современной клеточной инженерии – гибридизация (или фузия) и реконструкция клеток. Метод гибридизации клеток позволяет соединить воедино клетки даже совершенно различных микроорганизмов, а также клетки растений, животных и человека.
Фузия клеток осуществляется либо обработкой клеток полиэтиленгликолем, либо действием коротких электрических импульсов. Полученные в результате гибридные клетки – гибридомы – имеют два набора хромосом и сочетают в себе свойства обеих «родительских» клеток.
В 1974 г. Милстайн и Келлер осуществили гибридизацию нормальных лимфоцитов из селезенки иммунизированной мыши с миеломными клетками мыши. Продукт слияния антителопродуцирующих клеток с опухолевыми – гибридома, продуцирующая антитела одной специфичности (к одной антигенной детерминанте) и способная к неограниченному росту in vitro.
МКА широко используются для диагностики многих бактериальных и вирусных инфекций (гепатит В, грипп, герпес, бруцеллез); определения тканевых антигенов, рецепторов и медиаторов лимфоцитов; для диагностики и лечения злокачественных опухолей (созданы МКА, реагирующие со специфическими Аг рака легких, молочной железы, толстой кишки, поджелудочной железы).
Темы докладов для учебной конференции
1. История развития биотехнологии.
2. Биотехнология и разрешение экологических проблем.
3. Биотехнология: новые возможности в диагностике и лечении.
4. Новые лечебные препараты.
5. Возможности и перспективы генной инженерии.
