Опыт проводят на чашках с селективной средой, содержащей галактозу (среда ЭМС с индикатором эозин + метиленовый синий).
Постановка опыта трансдукции:
1. В опытную пробирку вносят 0,9 мл 3-часовой бульонной культуры-реципиента и 0,1 мл фаголизата трансдуцирующего фага «лямбда» в концентрации 10 частиц/мл (множественность инфекции 1,0). Смесь выдерживают при 37 °С в течение 30 мин.
2. Ставят 2 контроля: фаголизата на стерильность и культуры-реципиента, высевая их по 1,0 мл на чашки с селективной ЭМС-средой.
3. После инкубации делают высев 0,1 из опытной пробирки с трансдуцирующей смесью на чашку с селективной ЭМС-средой. Опыт учитывают через 48 ч. В контроле фаголизата рост должен отсутствовать. В контроле культуры-реципиента, не расщепляющей галактозу, микробы должны расти в виде бесцветных колоний. На опытной чашке вырастают окрашенные колонии трансдуктантов на фоне прозрачных, бесцветных колоний культуры-реципиента.
III. Трансформация – изменение свойств бактерий-реципиен-тов под влиянием ДНК, выделенной из бактерий доноров, т.е. непо-средственная передача фрагмента ДНК донора клетке-реципиенту.
Учесть опыт передачи устойчивости к стрептомицину у Bacillus subtilis.
В опыт были взяты:
1) ДНК, полученная из стрептомициноустойчивой культуры-донора;
2) стрептомициночувствительная культура-реципиент (в компетентном состоянии).
Опыт поставлен на чашках с МПА, в который добавлен стрептомицин в количестве 100 ед/мл.
Постановка опыта трансформации:
Культуру компетентных клеток соединяют в равных объемах с ДНК (например, по 0,5 мл). Выдерживают смесь в термостате 30 мин для контакта, после чего проводят высев на чашки с МПА и стрептомицином – по 0,2 мл смеси. Ставят 2 контроля: 1) высев на чашку ДНК; 2) высев стрептомициночувствительной культуры-реципиента.
Опыт учитывают через 24–48 ч. В обоих контролях рост должен отсутствовать, на опытных чашках вырастают колонии трансформантов, которые приобрели признак стрептомициночувствительности.
IV. Плазмиды – внехромосомные генетические структуры бактерий, представляющие собой циркулярные молекулы ДНК, способные к автономной репликации. Плазмиды располагаются в цитоплазме бактериальной клетки, некоторые могут включаться (интегрировать) в хромосому.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Впервые описана в 1985 г. Saiki и соавторами.
Сущность метода:
Это циклический процесс увеличения в геометрической прогрессии копий определенного фрагмента ДНК, протекающий под воздействием термостабильной ДНК-полимеразы и при строго заданных временных и температурных режимах. В качестве затравки для одновременного синтеза комплементарных цепей с противоположных концов матрицы используют 2 олигонуклеотида-праймера, способные специфически гибридизоваться с последовательностями нуклеотидов на противоположных концах 2 цепей участка ДНК.
В ходе повторяющихся циклов:
а) денатурация ДНК (температурный или щелочной гидролиз);
б) отжиг праймеров;
в) синтез ДНК-нитей, комплементарных матрице, ограниченной праймерами, цепей с помощью ДНК-полимеразы. Экспоненциально увеличивается количество дискретного фрагмента, фланкированного последовательностями нуклеотидов, соответствующих первичной структуре праймеров. В результате 30 циклов амплификации на базе одной молекулы ДНК можно получить более 1 млн копий необходимого участка ДНК – количества, достаточного для анализа с помощью других молекулярно-биологических методов (молекулярная гибридизация, гельэлектрофорез в присутствии бромистого этидия и др.)
Метод используется для диагностики многих вирусных инфекций в случаях недостаточного количества исследуемого материала; позволяет выявить нуклеиновые кислоты возбудителя не только из свежего материала, но и из высушенных и даже фиксированных препаратов; при отсутствии в крови АТ или при их недостаточном уровне для проведения серодиагностики.
Например: ПЦР позволяет обнаружить геном ВИЧ, встроенный в геном пораженных лимфоцитов, в случаях невозможности использования серологических методов.
