Молекулярно генетические методы

Для выявления и идентификации бактерий, вирусов, грибов и самых простых в последнее время начали широко использовать молекулярно генетические методы.

Реакция гибридизации ДНК и РНК (реакция генных зондов). Последовательность нуклеотидив ДНК и РНК является уникальной для геномов всех микроорганизмов. Любой участок нуклеиновой кислоты можно определить с помощью комплементарной копии ДНК или РНК, меченой ферментом или радиоактивной меткой (ДНК- и РНК-зонды). Такие зонды получены для большинства патогенных бактерий и вирусов. За их помощью проводят идентификацию ДНК или РНК возбудителей бактериальных и вирусных инфекций в клиническом материале. Реакция молекулярной

гибридизации является очень

 

чувствительной и высокоспецифической. Она дает возможность обнаруживать ДНК или РНК в очень малых количествах (1-10 пг).

Методика реакции генных зондов сводится к тому, что выделенные из патологического материала ДНК или РНК возбудителей денатурируют и наносят на специальные мембраны из нитроцеллюлозы.

 

Реакция гибридизации

После чего вносят ДНК- или РНК-зонды, выдерживают определенное время, делают многоразовую промывку, чтобы удалить реагенты, которые не прореагировали. Если использовали зонды с радиоактивной меткой, результат определяют с помощью g-счетчика. В случае, когда зонд мечен ферментом (например,пероксидазою), то к такому зонду добавляют субстрат (например, ортофенилдиамин). Ферментация субстрату приводит к изменению цвета, который можно наблюдать невооруженным глазом.

Полимеразная цепная реакция (ПЛР) – один из новейших методов выявления и идентификации бактерий и вирусов в исследуемых материалах. Принцип реакции базируется на многочисленном копировании (селективной амплификации) исследуемой ДНК ферментом ДНК-ПОЛИМЕРАЗОЙ. Образованные копии ДНК идентифицируют с помощью метода электрофореза.

 

ПЦР

Реакцию проводят в три этапа. На первом этапе при температуре 95 °С проходит денатурация двонитковои молекулы ДНК, ее розплетення и расхождение нитей.

На втором этапе (ренатурация) происходит гибридизация праймеров, то есть образование дволанцюгових комплексов праймер-матрицы, которые необходимы для инициирующего синтеза ДНК. Температура смеси при этом снижается до 55 °С.

На этапе синтеза (75 °С) проходит удлинение комплементарных нитей ДНК с помощью фермента ДНК-ПОЛИМЕРАЗы. Проводят 15-35 циклов синтеза.

Многоразовое повторение приводит к обогащению ДНК в исследуемом материале.

Метод ПЦР очень чувствителен. Его используют для выявления любого инфекционного агента, если известна нуклеотидна последовательность гена (или его фрагмента), специфического исключительно к данному возбудителю. Целесообразно использовать ПЛР в тех случаях, когда бактерии или вирусы имеют высокую изменчивость и находятся в исследуемом материале в малом количестве (даже одна молекула геномнои ДНК).

В настоящий момент ПЦР принадлежит к высокоэффективному молекулярно генетическому методу, какой доступный многим лабораториям. Длительность исследования составляет 2‑3 часа. Особенно целесообразно использовать его при определении и идентификации возбудителей туберкулеза, сифилиса, гонореи,микоплази, вирусов Спида, герпесов, гепатитов, рота- и энтеровирусов.

Итог: Основные виды идентификации чистых культур

Морфологическая идентификация – определение вида бактерий за их морфологическими признаками.

Принимают во внимание форму и внешние признаки бактерии (кокки, палочки, спирохеты), навнисть капсулы, споры, жгутиков.

 

 

Морфологическая и тинкториальна идентификация бактерий.

 

Культуральная идентификация – определение вида бактерий за их культуральными свойствами.

Принимают во внимание характер роста бактерий на жидких и плотных питательных средах (характеристика колоний, рост на жидкой среде).

 

 

 

Характеристика колоній

Биохимическая идентификация – определение вида бактерий за их биохимическими признаками.

Принимают во внимание цукролитични, протеолитические, пептолитични, редуцирующие, гемолитические и другие ферментативни свойства бактерий.

 

Рост микроорганизмов на среде Олькеницкого. 1 - незасеянная среда; 2 - микроорганизмы разлагают глюкозу до кислоты; 3 - микроорганизмы разлагают глюкозу и лактозу до кислоты и газа; 4 - микроорганизмы образуют сероводород; 5 - рост микроорганизмов, которые не разлагают сахара.

 

 

 

Рис. Определение редуцирующих свойств бактерий.

 

Серологическая идентификация – определение вида бактерий за их антигенным строением.

Для этого используют специфические аглютинуючи антимикробные сыворотки.