Ћекции.ќрг


ѕоиск:




 атегории:

јстрономи€
Ѕиологи€
√еографи€
ƒругие €зыки
»нтернет
»нформатика
»стори€
 ультура
Ћитература
Ћогика
ћатематика
ћедицина
ћеханика
ќхрана труда
ѕедагогика
ѕолитика
ѕраво
ѕсихологи€
–елиги€
–иторика
—оциологи€
—порт
—троительство
“ехнологи€
“ранспорт
‘изика
‘илософи€
‘инансы
’ими€
Ёкологи€
Ёкономика
Ёлектроника

 

 

 

 


Ётапы выделени€ чистых культур микроорганизмов




 

¬ыделение чистой культуры аеробних микроорганизмов состоит из р€да этапов.

¬ первый день (1 этап исследовани€) в стерильную посуду (пробирка, колба, флакон) забирают патологический материал. ≈го изучают за внешним видом, консистенцией, цветом, запахом и другим признаками, готов€т мазок, крас€т и исследуют под микроскопом. ¬ некоторых случа€х (остра€ гоноре€, чума) на этом этапе можно поставить предыдущий диагноз, а кроме того, подобрать среды, на которые будет засеватьс€ материал. «ан€л провод€т бактериологической петлей (примен€етс€ чаще всего), с помощью шпател€ за методом ƒригальского, ватно-марлевым тампоном. „ашки закрывают, переворачивают вверх дном, подписывают специальным карандашом и став€т в термостат при оптимальной температуре (37 ∞—) на 18-48 год. ÷ель этапа Ц получить изолированные колонии микроорганизмов.

ќднако, порой с целью нагромождени€ материала его засевают на жидкие питательные среды.

Ќа второй день (2 этап исследовани€) на поверхности плотной питательной среды микроорганизмы образуют сплошной, густой рост или изолированные колонии.  олони€ Ц это видимые невооруженным глазом скоплени€ бактерий на поверхности или в толще питательной среды.  ак правило, кажда€ колони€ формируетс€ из потомков одной микробной клетки (клоны), потому их состав достаточно однороден. ќсобенности роста бактерий на питательных средах €вл€ютс€ про€влением их культуральных свойств.

„ашки тщательным образом рассматривают и изучают изолированные колонии, которые выросли на поверхности агара. ќбращают внимание на величину, форму, цвет, характер краев и поверхности колоний, их консистенцию и другие признаки. ѕри потребности исследуют колонии под лупой, малым или большим увеличением микроскопа. —труктуру колоний исследуют в проходном свете при малом увеличении микроскопа. ќни могут быть гиалинови, зернистые, нитевидные или волокнистые, которые характеризуютс€ наличием переплетенных нитей в толще колоний.

’арактеристика колоний Ц важна составна€ часть работы бактериолога и лаборанта, ведь микроорганизмам каждого вида присущи свои особенные колонии.

 

’арактеризовать колонии можно за разными признаками. «а величиной (диаметром) их раздел€ют на больших (4-6 мм и больше), средних (2-4 мм), мелких (1-2 мм), карликовых или точечных (меньше 1 мм). ‘орма колоний может быть самой разнообразной: правильно кругла€, неправильна€ (амебоподибна), ризоидна. ќни бывают прозрачными, что пропускают светло, и мутными.

«а рельефом и контуром формы в вертикальном разрезе колонии раздел€ютс€ на плоских, выпуклых, куполообразных, краплеподибни, конусообразные,плоскоопукли, плоские, что стелютс€ по поверхности среды, с вдавленным центром, из припидн€тою в виде соска серединой.

ѕоверхность колоний может быть матовой или блест€щей, с гл€нцем, сухой или влажной, гладкой и блест€щей или шершавой. √ладкие и блест€щие колонии помечают как S-формы (smooth Ц гладкий и блест€щий), а шершавые Ц R-формы (rough Ц шершавый, неравный).

‘орма шершавых поверхностей также может быть разнообразной: морщинистой, гирозной, бородавчатой, шагреневой, иметь радиальную исчерченность и тому подобное.

ѕодавл€ющее большинство микроорганизмов образуют бесцветные колонии или мутно молочного цвета. ќднако некоторые из них формируют цветные колонии. »х цвет определ€етс€ пигментом, который синтезируют бактерии: белые, кремовые, желтые, золотистые, синие, красные и тому подобное.

ѕри доторканни к колонии петлей можно определить ее консистенцию: пастообразна€, в€зка€ или слизиста€, суха€, хрупка€ и тому подобное.

»з подозрительных колоний готов€т мазки, окрашивают за методом √рамма дл€ изучени€ морфологических и тинкториальних свойств возбудителей, исследуют подвижную бактерий в Увис€чейФ или УраздавленойФ капле. Ёти признаки имеют чрезвычайно большое диагностическое значение при характеристике отдельных видов микроорганизмов.

ќстатки исследуемых колоний осторожно, не каса€сь других, снимают из поверхности среды и засевают на скошенный агар или на секторы чашки ѕетри с питательной средой дл€ получени€ чистой культуры. ѕробирки или чашки с посевами помещают в термостат при оптимальной температуре на 18-24 год.

—егодн€, как правило, бактериологи пытаютс€ пользоватьс€ стандартными сухими питательными средами, которые выпускает микробиологическа€ промышленность. “акие среды позвол€ют существенно улучшить результаты микробиологических исследований и стандартизировать их.

Ќа жидких питательных средах бактерии также могут расти по-разному, хот€ особенности про€влений роста более бедны, чем на плотных.

Ѕактерии способны вызывать диффузное помутнение среды, цвет его при этом может не измен€тьс€ или приобретает цвет пигмента. “акой характер роста чаще всего наблюдаетс€ в большинстве факультативно анаэробных микроорганизмов.

ѕорой происходит образование осадка на дне пробирки. ќн может быть крошкообразным, гомогенным, в€зким, слизистым и др. —реда над ним может оставатьс€ прозрачной или становитьс€ мутной. ≈сли микробы пигмента не образуют, осадок имеет сирувато-билий или желтоватый цвет. ѕодобным чином растут, как правило, анаэробные бактерии.

ѕристеночный рост про€вл€етс€ образованием хлопьев, зерен, прикрепленных к внутренним стенкам пробирки. —реда при этом остаетс€ прозрачной.

јеробные бактерии имеют тенденцию к поверхностному росту. „асто образуетс€ нежна€ бесцветна€ или голубовата€ пленка в виде едва заметного налета на поверхности, котора€ исчезает при стр€хивании или взбалтывании среды. ѕленка может быть влага, толста€, иметь в€занку, слизистую консистенцию и прилипать к петле, т€нетс€ за ней. ќднако, встречаетс€ и плотна€, суха€, хрупка€ пленка, цвет которой зависит от пигмента, который производитс€ микроорганизмами.

¬ случае необходимости изготовл€етс€ мазок, окрашиваетс€, исследуетс€ под микроскопом, а микроорганизмы засеваютс€ петлей на поверхность плотной питательной среды дл€ получени€ изолированных колоний.

Ќа третий день (3 этап исследовани€) изучают характер роста чистой культуры микроорганизмов и провод€т ее идентификацию.

—начала обращают внимание на особенности роста микроорганизмов на среде и делают мазок, крас€ его за методом √рама, с целью проверки культуры на чистоту. ≈сли под микроскопом наблюдают бактерии однотипной морфологии, размеров и тинкториальних (способность краситьс€) свойств, делают вывод, что культура чиста. ¬ некоторых случа€х уже за внешним видом и особенност€ми их роста можно сделать вывод о виду выделенных возбудителей. ќпределение вида бактерий за их морфологическими признаками называетс€ морфологической идентификацией. ќпределени€ вида возбудителей за их культуральными признаками называют культуральной идентификацией.

ќднако этих исследований недостаточно, чтобы сделать окончательный вывод о виду выделенных микробов. ѕотому изучают биохимические свойства бактерий. ќни достаточно разнообразны.

 

„аще всего исследуют сахаролитические, протеолитические, пептолитические, гемолитические свойства, образовани€ ферментов декарбоксилаз, оксидазы,каталазы, плазмокоагулазы, ƒЌ -азы, фибринолизина, восстановление нитратов в нитриты и тому подобное. ƒл€ этого существуют специальные питательные среды, которые засевают микроорганизмами (пестрый р€д √исса, ћѕЅ, свернута€ сыворотка, молоко и др.).

ќпределение вида возбудител€ за его биохимическими свойствами называетс€ биохимической идентификацией.

ƒл€ исследовани€ способности бактерий расщепл€ть белки (протеолитические свойства) используют молоко или среду с желатином. ѕротеолиз в молоке выражаетс€ растворением сгустка казеина, который образован бактери€ми, которые свертывают молоко.

—реды с желатином готов€т на м€сной воде, добавл€€ 1 % пептону, 0,5 % хлориду натри€ и 10-20 % желатину. «ан€л делают уколом. ѕротеолиз про€вл€етс€ разжижением столбика среды. ѕоскольку некоторые виды бактерий отличаютс€ за особенност€ми разжижени€ желатина, этот признак можно учитывать при их идентификации.

ѕептолитические свойства (способность расщепл€ть пептоны Ц продукты неполного гидролиза белка) обнаруживают с помощью ћѕЅ и пептонной воды. »х засевают микроорганизмами, а затем определ€ют образование конечных продуктов Ц аммиаку, сероводороду и индолу. ƒл€ нахождени€ аммиака в пробирку вставл€ют и притискивают пробкой красную лакмусовую бумажку. ¬ атмосфере аммиака он приобретает синюю расцветку. »ндикатором на сероводород €вл€етс€ раствор ацетата свинца, который при аналогичных услови€х определени€ окрашивает фильтровальную бумагу, смоченную индикатором, в черный цвет за счет образовани€ сульфида свинца.

»ндол можно обнаружить с помощью полоски фильтровальной бумаги, смоченной 12 % раствором щавелевои кислоты. «а наличием индолу бумажка приобретает розовый цвет. „увствительнее €вл€етс€ метод ≈рлиха. —огласно с общеприн€тым методом пробкой пробирки притискивают бумажку, пропитанную специальным индикатором (спиртной раствор парадиметиламидобензальдегиду). ѕри наличии индолу цвет его измен€етс€ на сиренево розовый или малиновый. ¬ другом варианте определени€ индолу до 48-часовой бульйоннои культуры бактерий добавл€ют 1-2 мл серного эфира, а затем Ц реактив Ёриха. ¬ нижней части сло€ эфира за 1-2 мин по€вл€етс€ €ркое малиновое кольцо.

¬ микробиологической практике широко используютс€ дифференциально диагностические среды ≈ндо, Ћевина, ѕлоскирева, которые позвол€ют обнаружить разложение лактозы бактери€ми. ќни позвол€ют проводить первичную дифференциацию бактерий кишечного тракта, что чрезвычайно важно дл€ быстрого выделени€ чистых культур с их следующей идентификацией. Ёти среды есть елективними дл€ многих представителей семьи кишечных бактерий. ¬ыпускаютс€ они в сухом виде, потому их приготовление в лаборатори€х не нуждаетс€ в затрате времени.

—реда Ёндо состоит из сухого питательного агара, 1 % лактозы и индикатора фуксина, обесцвеченного раствором сульфита натри€. —вежа€ среда имеет слабую розовую расцветку. ѕри росте лактозопозитивних микроорганизмов, тех, которые расщепл€ют лактозу (E. coli), их колонии окрашиваютс€ в темно-красный цвет с металлическим блеском.  олонии лактозонегативних микробов (сальмонели, шигели) на этой среде бесцветны.

¬ состав среды Ћевина также входит ћѕј, лактоза, одинзамещенный фосфат кали€, индикаторы метиленовий синей, эозин. Ќативне среда имеет фиолетовый цвет.  олонии лактозопозитивных бактерий имеют темно-синюю расцветку, а лактозонегативные Ц розовый оттенок.

—ухой бактоагар ѕлоскирева (Ѕактоагар ∆е) содержит в составе агар с сол€ми желчных кислот лактозу, цитрат натрию, гипосульфит, фосфат натри€,бриль€нтовый зеленый, соду кальцинированную, йод и нейтральный красный. ћикроорганизмы, которые расщепл€ют лактозу, образуют колонии розового цвета, а те, что ее не ферментируют Ц бесцветные.

¬ микробиологической практике часто возникает потребность исследовать ферментацию не только одного, а нескольких цукрив сразу. — этой целью используют среды √исса. ќни могут иметь жидкую и полужидкую консистенцию.

ќсновой жидкой среды €вл€етс€ 1 % пептонна€ вода с 0,5 % натрию хлорида, 1 % углеводов (глюкозы, мальтозы, лактозы, сахарозы, манниту и др.).   нему добавл€ют индикатор јндреде (кислый фуксин в 1 н растворе NаOH). ”станавливают рЌ 7,2, при нем среда имеет желтый цвет. —реды с разными углеводами разливают в отдельные пробирки, в которые устанавливают поплавок Ц запа€нную из одного конца стекл€нную трубочку длиной 3 см открытым концом книзу. —терилизуют парой под давлением 0,5 атм 15 мин.

ѕосле посева бактерий, если они ферментируют углеводы, наблюдают по€вление красной расцветки, котора€ свидетельствует об изменении рЌ в кислую сторону (образование кислоты), а порой из поплавка вытесн€етс€ жидкость. “огда делают вывод об образовании газа. —ледовательно, возможны три варианта при учете результатов посева на середовише √исса: микроорганизмы не ферментируют субстрату (негативный ответ) или бактерии раскладывают углеводы (позитивный ответ) с образованием кислоты без газа или кислоты и газа.

”читыва€, что микроорганизмы по-разному действуют на углеводы (разлагают или не разлагают), при конечном учете результатов наблюдают пробирки с измененным или неизмененным цветом жидкости. Ёто создает впечатление пестрости, а такой р€д называют пестрым р€дом √исса.

¬ насто€щий момент в большинстве случаев пользуютс€ набором сухих сред дл€ определени€ цукролитичних ферментов, из которых готов€т полужидкие пестрые р€ды. ¬ отличие от предыдущей группы, в их состав вход€т индикаторы ¬– (смесь водного голубого с розоловою кислотой) или бромтимоловий синей илибромкрезоловий пурпурный. ѕри наличии газа наблюдаютс€ пузырьки или разрывы питательной среды в толще агара. ѕри пидкисленни среды с индикатором ¬– оно становитс€ синим, а при пидлужнюванни Ц красным (бромкрезоловий пурпурный при образовании кислоты дает кое-что фиолетова€ и лимонно-желта€ расцветка, а бромтимоловий синей Ц зеленкувате или лимонное). ¬ щелочной среде они имеют соответственно интенсивно фиолетовый и синий цвет с зеленкуватимбликом.





ѕоделитьс€ с друзь€ми:


ƒата добавлени€: 2015-05-07; ћы поможем в написании ваших работ!; просмотров: 6460 | Ќарушение авторских прав


ѕоиск на сайте:

Ћучшие изречени€:

„тобы получилс€ студенческий борщ, его нужно варить также как и домашний, только без м€са и развести водой 1:10 © Ќеизвестно
==> читать все изречени€...

2243 - | 2123 -


© 2015-2024 lektsii.org -  онтакты - ѕоследнее добавление

√ен: 0.015 с.