Среда Рессела является полужидким агаром с лактозой (1 %) и глюкозой (0,1 %) и индикатором ВР. После разливания его в пробирки их кладут так, чтобы образовался столбик агара и была скошена поверхность. Микроорганизмы засевают петлей сначала уколом в столбик, а затем по скошенной поверхности. Если бактерии ферментируют лактозу и глюкозу, наблюдают изменение цвета (подкисление) всей среды на синей. Если микробы способны метаболизировать только глюкозу, в этом случае изменяет цвет столбик среды. При условии образования газа наблюдают за появлением его пузырьков или разрывами агара.
Трисахарный агар с мочевиной Олькеницкого – более сложная среда сравнительно с предыдущим. Он позволяет определить ферментацию лактозы, сахарозы, глюкозы, образования сероводорода и наличие у бактерий фермента уреазы. В состав среды соответственно вводят сухой питательный агар, лактозу, сахарозу, глюкозу, комплексную соль аммоний-железо сульфат, тиосульфат натри, мочевину, индикатор феноловый красен. Готовая среда имеет бледно-розовый цвет.
При расщеплении сахаров феноловый красный окрашивает среду в желтый цвет. Поскольку глюкоза, имеющаяся в небольших концентрациях (0,1 %), в аэробныхусловиях (скошенная поверхность) бактерии полностью будут утилизировать ее за первые часы роста. Через 18-24 год они потребляют и пептоны как белковую питательную основу. При этом образуется аммиак, который делает среду щелочной, предоставляя ей красного цвета. Однако в столбике агара желтый цвет остается, потому что там сохраняются кислые конечные продукты, которые обеспечивают низкий уровень рН.
Энтеробактерии, которые разлагают лактозу и глюкозу, подкисляют среду во всей пробирке (желтый цвет столбика и скошенной поверхности). Поскольку лактозы (1 %) в 10 раз больше, чем глюкозы, через 18-24 год инкубации ее запасы еще не исчерпаны, потому сохраняется желтый цвет среды. Однако через 48 год за счет расщепления пептонов можно наблюдать за его покраснением (сдвиг рН в щелочную сторону).
Если бактерии образуют газ (углекислый, водород) при ферментации сахаров, появляются разрывы среды или происходит скопление газа на дне, который поднимает агар в пробирке.
Сероводород микробы образуют из неорганических соединений, благодаря ферменту тиосульфатредуктазе. Взаимодействуют с сероводородом соли железа, которые, вступая с ним в реакцию, образуют сульфид железа в виде нерастворимого преципитата черного цвета в столбике.
Уреаза, которую продуцируют бактерии, разрушает мочевину с выделением большого количества аммиаку, под воздействием которого вся среда алеет. Потому при наличии уреазопозитивних штаммов провести учет ферментации цукрив невозможно. В таких случаях необходимо использовать другие среды.
За последние годы в практике микробиологических лабораторий начали использовать специальные тест-системы для определения разнообразных свойств бактерий: “Roche”, “API”, “Enterotest”, пластины и диски индикаторные биохимические. Они удобны для пользования, надежные, позволяют определять 12-20 и больше разнообразных признаков, значительно облегчить идентификацию микробов.
Гемолитическая активность микроорганизмов является одним из самых существенных признаков их вирулентности, потому ее определение стало рутинной процедурой любой специализированной лаборатории. С этой целью используют кровяной МПА. Его готовят из растопленного и охлажденного до 45-50 °С питательного агара, к которому добавляют 5-10 % дефибринованои или свежей крови животного (барана или кролика). Агар с кровью тщательным образом перемешивают, не допуская образования пены, и разливают в чашки Петри. Если бактерии продуцируют гемолизини, вокруг колоний или штрихов посева образуются зоны просветления на матовом красном фоне. По цвету гемолиза (бесцветный, зеленоватый) можно определить тип гемолизинов (альфа-, бета-, гамма-, дельта- и тому подобное).
Чтобы обнаружить липолитические свойства микробов, в состав питательных сред вводят липиды или жироподобные субстанции – твини. Бактерии при таких условиях образуют радужные венчики вокруг колоний при расщеплении липидов.
Редуцирующие свойства изучают, добавляя в состав сред красители (метиленовий синей, например), которые способны возобновляться. Фиксируя время изменения цвета индикатора, можно судить о степени выражение редуцирующей активности.
Декарбоксилазную активность бактерий оценивают на специальных средах с аминокислотами (лизином, орнитином, глютаминовой кислотой и др.) и соответствующими индикаторами.
С целью установления видовой принадлежности бактерий часто изучают их антигенное строение, то есть проводят идентификацию за антигенными свойствами. Каждый микроорганизм имеет в своем составе разные антигенные субстанции. В частности, представители семьи ентеробактерий (ешерихии, сальмонели, шигели) содержат оболочковый О-антиген, джгутиковий Н-антиген и капсульный К-антиген. Они неоднородны за своим химическим составом, потому существуют во многих вариантах. Их можно определить с помощью специфических аглютинуючих сывороток. Такое определение вида бактерий носит название серологическойидентификации. Ее относят к одному из главных методов установления вида выделенной культуры. Чаще всего используется ориентировочная реакция агглютинации на стекле. С этой целью на предметное скельце наносят разные диагностические сыворотки (против отдельных возбудителей или их антигенов), а затем в каждую каплю вносят стерильной петлей небольшое количество чистой культуры. За несколько минут наблюдают за феноменом агглютинации. Образованиеаглютинату (хлопьев) свидетельствует о гомологичнисть антигенов возбудителя и антител диагностической сыворотки, что позволяет определить вид инфекционного агента. При наличии позитивной ориентировочной реакции агглютинации ее ставят в развернутом варианте (реакция агглютинации Грубера).
При некоторых инфекционных заболеваниях (дифтерия) идентификацию проводят за токсигенными свойствами микробов. Метод основывается на определениитоксигенной активности коринебактерий дифтерии с помощью реакции преципитации. Образование линий преципитации между колониями токсигенних штаммов и бумажкой, пропитанной антитоксинной сывороткой, свидетельствует о позитивной реакции.
Иногда идентификацию бактерий проводят, заражая лабораторных животных чистой культурой и наблюдая за теми изменениями, которые вызывают возбудители в организме (туберкулез, ботулизм, столбняк, сальмонеллез и тому подобное). Такой метод называют идентификацией по биологическими свойствами. Как объекты – чаще всего используют гвинейских свинок, белых мышей и крыс.
Очень важным при выделении микроорганизмов является определение их чувствительности к антибиотикам с целью выбора оптимального препарата для лечения. Чаще всего пользуются методом стандартных дисков (метод диффузии в агар, диско-дифузийний метод). Для этого на поверхность специальной плотной питательной среды в чашках Петри засевают культуру микроорганизмов и налагают бумажные диски, пропитанные разными антибиотиками. Посевы инкубируют при оптимальной температуре 18-24 год и измеряют зоны задержки роста бактерий вокруг дисков с антибиотиками. За размерами этих зон определяют принадлежность бактерий к чувствительным, умеренно резистентным или стойким штаммам.
На основании изучения морфологических, культуральных, биохимических, антигенных, биологических и других свойств микробов делают окончательный вывод об идентификации. Например: “Выделено Escherichia coli” или “Выделенный возбудитель принадлежит к виду Staphylococcus epidermidis”.
Запомните этапы выделения чистых культур аеробних бактерий:
1 - макро- и микроскопическое изучение исследуемого материала и посев на плотные питательные среды для получения изолированных колоний.
2 - макро- и микроскопическое изучение колоний и пересев их на скошенный агар для получения чистой культуры;
3 - проверка культуры на чистоту и ее идентификация;
4 - вывод о выделенной культуре.
