Определение способности золотистого стафилококка продуцировать β - лактамазу

В колбу с 0,5 мл суточной бульонной культуры стандартного штамма стафилококка, чувствительного к пенициллину, вносят 20 мл расплавленного и охлажденного до 45⁰С питательного агара, перемешивают и выливают в чашку Петри. После застывания агара в центр чашки на поверхность среды помещают диск, содержащий пенициллин. По радиусам диска петлей засевают исследуемые культуры. Посевы инкубируют при 37⁰С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта. О способности исследуемых бактерий продуцировать β - лактамазу судят по наличию роста стандартного штамма стафилококка вокруг исследуемых культур до самого диска.

 

Выявление метициллинрезистентных стафилококков

На чашку Петри производят посев сплошной линией эталонной культуры, которая устойчива к метициллину и исследуемую культуру раздельно. Перпендикулярно линии посева ставят полоску фильтровальной бумаги, содержащую 25 мкг метициллина. После 18 часов инкубирования при 37⁰С определяют результат, если исследуемая культура образовала зону задержки вокруг полоски бумаги, то она чувствительна к антибиотику, если не образовала зону задержки роста, то метициллинрезистентна.

 

Определение концентраций антибиотиков в жидкостях и тканях организма, как показатель эффективности антибиотикотерапии

 

Лечебный эффект антибиотикотерапии определяется взаимоотношением ряда факторов, включающих свойства микроба-возбудителя заболевания, макроорганизма и антибиотика.

Для выбора оптимального режима лечения важно знать особенности кинетики антибиотика в организме больного (особенности всасывания, распределения и проникновения в ткани и жидкости, скорость выведения и др.). Эти показатели в сопоставлении со значениями МПК антибиотика для выделенного возбудителя дают возможность обоснования индивидуального плана лечения больного и прогнозирования его возможной эффективности.

При определении концентрации антибиотиков в организме наиболее широко применяются микробиологические методы исследования, основанные на способности антибиотика задерживать рост тест-микроба. Среди микробиологических методов определения концентраций антибиотиков в жидкостях и тканях организма наибольшее распространение получили метод диффузии в агар и метод серийных разведений в жидкой питательной среде.

 

Метод диффузии в агар

 

Метод основан на сравнении степени угнетения роста тест-микроба определенными концентрациями антибиотика в испытуемом материале с угнетением его роста известными концентрациями стандарта антибиотика. Подавление роста тест-микроба осуществляется за счет диффузии антибиотика из исследуемого материала в плотную среду. Рабочими стандартами служат специально изготовленные очищенные образцы антибиотиков, активность которых устанавливают по международным стандартным препаратам. Стандарты сохраняются в запаянных ампулах при температуре 4-10⁰С. На этикетках ампул указано содержание единиц или микрограммов в 1 мг препарата.

Методом диффузии в агар можно определить концентрацию всех антибиотиков, содержащихся в жидкостях (в крови, спинномозговой жидкости, моче, желчи, асцитической жидкости и т.д.) и в тканях организма (в легких, печени, почках, мозге, мышцах и др.).

Для определения концентрации антибиотика в сыворотке кровь после образования сгустка центрифугируют, сыворотку отсасывают и вносят в специальные лунки, изготовленные в агаровых пластинках, либо разводят нормальной сывороткой человека или соответствующим каждому антибиотику буферным раствором.

С целью определения концентрации антибиотиков в тканях органы после удаления остатков крови взвешивают и гомогенизируют путем растирания с кварцевым песком или в специальном смесителе. К гомогенату добавляют дистиллированную воду или соответствующий буфер. Полученную взвесь центрифугируют 30 минут при 2500-3000 об/мин. Концентрацию антибиотиков определяют в надосадочной жидкости.

Для получения воспроизводимых результатов необходима строгая стандартизация опытов. Скорость диффузии растворов в агар зависит от химической природы антибиотиков, состава и рН агаровой среды, буфера в котором готовят рабочие растворы стандарта, испытуемого материала, температуры и времени инкубации. Поэтому при определении концентрации антибиотиков в испытуемых субстратах подбирают оптимальные условия культивирования тест-культуры, оптимальные по составу и рН питательные среды, буферные растворы, обеспечивающие максимальную диффузию растворов антибиотика в среду и четкость очертания зон. Определение проводят по схеме, общей для всех антибиотиков, которая состоит из нескольких этапов.

1) Подготовка чашек со средами и тест-микробом.

С этой целью можно использовать чашки Петри с разлитыми в один или два слоя питательными средами. При этом для нижнего слоя используют «голодные» незасеянные среды, для верхнего или одного слоя агаровую среду засевают соответствующим тест–микробом. Обычно используют питательные среды, приготовленные на бульоне Хоттингера. Каждому антибиотику соответствует среда с определенным содержанием аминного азота. Например, для пенициллинов, ампициллина, тетрациклина, гентамицина, канамицина, полимиксина - 130-140 мг%, а для стрептомицина, эритромицина, олеандомицина, неомицина – 30-35 мг% аминного азота.

Среду, предназначенную для нижнего слоя, разливают в чашки Петри, которые располагают в горизонтальной плоскости, отрегулированной по ватерпасу. Нижний слой можно разливать заранее, сохраняя чашки при температуре 2-8⁰С в течение 3-5 сут. Питательную среду для верхнего слоя заражают взвесью соответствующего тест-микроба, который имеет наибольшую чувствительность к данному антибиотику. Аспорогенные культуры вносят в среду при температуре не выше 48-50⁰С, взвесь спор при 65-70⁰С. Посевная доза тест-микроба должна быть предварительно установлена для каждой серии среды, так как увеличение плотности посева может сопровождаться образованием густого микробного «газона» и уменьшением размеров зон задержки роста тест-микроба, а при недостаточном количестве засеянного микробных клеток не будет образования сплошного роста, что в дальнейшем затруднит измерение диаметра зоны подавления.

2) Приготовление рабочих растворов стандарта антибиотика и испытуемого материала.

Для приготовления растворов стандарта антибиотика делают точную навеску на аналитических весах. Навеску растворяют в соответствующем растворителе (например, для пенициллинов - буфер №1 фосфатный 1/15 М, рН 6,8-7,0, калия фосфат однозамещенный - 3,63 г, натрия фосфат двузамещенный - 7,13 г, вода дистиллированная – до 1000 мл; для ампициллина, оксациллина - 1/15 М фосфатный буфер, рН 6,8-7,0; для эритромицина – 1 мл этанола на 10 мг навески, буфер №4 до 1 мг/мл; для канамицина - вода дистиллированная и т.д.) расчёта 1 мг или 1 мл или 1000 ЕД в 1 мл (основной раствор). Дальнейшее разведение основных растворов доводят до нужных концентраций.

Для стандарта каждого антибиотика определяют концентрацию раствора, обеспечивающую образование оптимальных зон задержки тест-культуры (контрольная концентрация). При приготовлении растворов испытуемого материала нужно стремиться создать концентрации антибиотиков в близких контрольной концентрации стандарта пределах. Приготовленные разведения стандарта антибиотика и испытуемого материала вносят в стерильные цилиндрики из нержавеющей стали или алюминия, расставленные по 6 в чашке на поверхности застывшей питательной среды. Вместо цилиндриков можно вносить испытуемые растворы в предварительно сделанные в толще агара лунки диаметром 8 мм или пропитывать ими бумажные диски. Однако при использовании дисков иногда получаются зоны неправильной величины и формы, что связано с неравномерной диффузией антибиотика из диска. Растворы стандарта и испытуемого образца вносят в цилиндрики или лунки специальной капельницей или пипеткой в объеме 0,1 мл, чередуя стандартный и испытуемый растворы. Для каждого испытания используют не менее 3-х чашек. Чашки инкубируют при 37⁰С в течение 16 часов, затем измеряют диаметры зон задержки роста тест-микроба, образуемыми растворами.

3) Расчет активности испытуемого препарата.

Концентрацию антибиотика в испытуемом субстрате определяют по стандартной кривой. Для построения стандартной кривой используют 5 концентраций стандартного препарата. Одна из концентраций, по которой вносят поправки для всех других, является контрольной. Для каждой концентрации, кроме контрольной, используют 3 чашки (всего 12 чашек). В 3 цилиндрика или лунки каждой чашки вносят раствор контрольной концентрации, в 3 другие – одну из взятых концентраций стандарта. После измерения зон задержки роста для каждой концентрации выводят среднюю величину зоны на 3 чашках, затем находят среднюю величину зоны для контрольной концентрации на всех чашках (12 х 3 = 36 зон).

По разности между средней величиной зоны контрольной концентрации, выведенной из всех чашек, и средней величиной зоны контрольной концентрации, определенной из 3 чашек с каждой отдельной концентрацией находят поправку к величине зоны данной концентрации. Поправку прибавляют к средней величине зоны данной концентрации, если она положительная, и вычитают, если отрицательная.

Пример. Средняя величина зоны контрольной концентрации 1 ЕД/мл равна 19,2 мл (выведена из 36 зон). Средняя величина зоны для той же концентрации, выведенная из 3 чашек, на которых испытывался раствор, соответствующий 0,8 ЕД/мл, равна 19 мм. Величина поправки составляет +0,2 мм. Средняя величина зоны для концентрации 0,8 ЕД/мл составляет 17,9 мм, после внесения поправки: 17,9 мм + 0,2 мм = 18,1 мм. Таким же образом исправляют значение величин зон для остальных концентраций, используемых при построении стандартной кривой.

На полулогарифмической сетке расчёта активности антибиотиков по исправленным значениям величин зон взятых концентраций и средней величине зоны контрольной концентрации строят стандартную кривую, откладывая на оси абсцисс величины зон против значений соответствующих концентраций на оси ординат. При постоянных условиях опыта стандартной кривой можно пользоваться длительно, проверяя угол наклона для каждой вновь приготовленной серии питательной среды по 2-3 концентрациям стандарта на 3-5 чашках.

При определении концентрации антибиотика в сыворотке или другом субстрате испытуемый субстрат разводят до предполагаемого уровня, близкого к контрольной концентрации. В зависимости от количества испытуемого материала применяют одну или несколько чашек на каждое разведение. Параллельно с испытуемым материалом на каждую чашку вносят контрольную концентрацию стандарта антибиотика. После инкубации при 37⁰С в течение 16-18 часов измеряют зоны задержки роста тест-микроба, образуемые контрольной концентрацией стандарта и испытуемым раствором.

Разность между найденными средними величинами зон испытуемого образца и контрольной концентрации прибавляют к величине зоны контрольной концентрации на стандартной кривой. Затем по кривой находят концентрацию, соответствующую найденной величине зоны в ЕД/мл. Умножая полученную концентрацию на степень разведения испытуемого материала, определяют содержание антибиотика в 1 мл испытуемого материала. Точность метода составляет ±10%.

При определении активности антибиотиков методом диффузии в агар ответ получают через 16-18 часов. Существуют ускоренные методы определения, с помощью которых результаты можно установить уже через 3-5 часов. Ускорение опыта достигается путем увеличения посевной дозы тест-культуры на 1 мл питательной среды, повышением температуры инкубации до 38-45⁰С или проявлением плохо видимых зон и слабо выраженных микробных газонов через 3-5 часов инкубации химическими методами. В последнем случае поверхность питательной среды обрабатывают 2% раствором красной кровяной соли и 1% раствором железо - аммиачных квасцов. Микробный газон при этом окрашивается в темно-синий цвет, на фоне которого четко вырисовываются светлые зоны подавления роста.

 

Метод серийных разведений

Для определения содержания антибиотика в жидкостях организма (кровь, экссудаты полостей, ликвор и др.) можно также использовать метод последовательных разведений в жидкой среде.

Питательной средой при этом служит среда Гисса с глюкозой и реактивом Андреде (рН 7,2) или фенол - сывороточная среда (2 мл

10% раствора глюкозы, 2 мл сыворотки крови человека, 6 мл дистиллированной воды и 0,25 мл насыщенного раствора фенолрота).

Среды заражают стандартизированной взвесью определенного для каждого антибиотика тест-микроба из расчета 1000-10000 микробных клеток на 1 мл среды. Зараженную среду разливают по 0,2 или 0,5 мл в стерильные пробирки. Для каждого образца готовят два ряда по 10 пробирок в каждом. Первый ряд служит для разведения раствора стандарта антибиотика (стандарт разводят до нужной концентрации сывороткой человека или здорового животного), второй – для разведения испытуемого материала (например, сыворотки). Разведения (двукратные, последовательные) испытуемого раствора и стандартного образца производят в объеме 0,2 или 0,5 мл засеянной среды. Контролями опыта служат незаражённая (контроль прозрачности и стерильности) и заражённая соответствующим тест-микробом (контроль роста микроба) среды. Результаты учитывают после 16-18 ч инкубации при 37⁰С по изменению цвета (среда Гисса становится розовой, фенол - сывороточная - из красной при рН 7,2 становится желтой за счет сбраживания растущими микроорганизмами глюкозы и изменения рН) и помутнению среды. Для того, чтобы установить концентрацию антибиотиков в исследуемой сыворотке, умножают наибольшее разведение сыворотки, задерживающее рост тест-микроба (разведение в последней пробирке с прозрачной, не изменившей цвета средой), на наименьшую концентрацию стандарта антибиотика в пробирке с отсутствием роста. Полученная величина соответствует содержанию антибиотика в 1 мл исследуемой сыворотки. Например, концентрация пенициллина в сыворотке крови определяют по следующей таблице 5.

 

Таблица 5. - Определение содержания пенициллина в сыворотке

 

Разведение сыворотки Рост тест-микроба	1:2 -	1:4 -	1:8 -	1:16 +	1:32 +	1:64 +
Концентрация стандарта пенициллина в среде в ЕД/мл Рост тест-микроба	0,2 -	0,1 -	0,05 -	0,025 -	0,125 +	0,0063 +
Примечание: (+) – рост микроба; (-) – отсутствие микроба

 

В приведённом примере раствор стандарта пенициллина задерживает рост тест-микроба в концентрации 0,025 ЕД/мл, а испытуемая сыворотка – в разведении 1:8. Содержание пенициллина в неразведённой сыворотке соответствует 0,025 x 8=0,2 ЕД/мл.

Кроме определения концентрации антибиотиков в тканях и жидкостях организма, описанные микробиологические методы используют для определения активности образцов на всех стадиях производства антибиотиков, для определения стабильности антибиотиков или препаратов, содержащих антибиотики. Химические или физико-химические методы исследования количественного содержания антибиотика в препарате применяют в том случае, если получаемые результаты совпадают с результатами микробиологической оценки активности.

Разумеется, указанные методы определения антибиотикочувствительности бактерий должны проводиться в сертифицированных, аттестованных (лучше аккредитованных) микробиологических лабораториях. Однако большинство районных больниц не имеют таковых, в связи с чем ВОЗ в порядке исключения допускает возможность использования ориентировочных методов оценки антибиотикочувствительности. Например, по мазку из исследуемого материала, окрашенного по Граму, определив наличие или преобладание грамположительных или грамотрицательных бактерий, можно ориентировать клиницистов на выбор стартовой антибиотикотерапии. Допускается также (В.В. Мельникова, 1984) определение антибиотикочувствительности совокупной микрофлоры без выделения чистых культур, что занимает 18-24 часа от момента поступления материала в лабораторию. В последующие дни при наличии условий возможно более детальное исследование чистых культур бактерий с коррекцией при необходимости начатой стартовой антибактериальной терапии.

Указанные нестандартные ориентировочные методы, на наш взгляд, могут быть подспорьем в выборе стартовой антибиотикотерапии. По крайней мере это лучше, чем эмпирическая терапия «с потолка», которая, к сожалению, характерна не только для районных, но и ряда областных центров.

Таким образом, определение чувствительности возбудителей инфекционного процесса к антибактериальным препаратам является основным лабораторным методом, на основе которого осуществляется выбор оптимального и эффективного препарата для лечения.