Серийные разведения в жидких средах

 

С помощью этого метода можно установить МИК и МБК препарата для исследуемого микроорганизма. Для исследования можно брать различные объемы питательной среды (1-10 мл). Обычно в 7 пробирках готовят серию двойных разведений препарата на жидкой питательной среде. Концентрацию препарата уменьшают соответственно от 100 до 3,12 мкг/мл в зависимости от активности препарата. Объем среды в каждой пробирке составляет 1 мл. Для контроля берут пробирку, содержащую чистую питательную среду. В каждую пробирку вносят по 0,05 мл физиологического раствора, содержащего 10⁶ /мл микробных клеток. Пробирки ставят в термостат на 10-18 часов при температуре 37⁰С. Результаты учитывают по изменению оптической плотности среды визуально или нефелометрически. Можно использовать модифицированный метод, используя среду, дополненную глюкозой и индикатором. При росте микроорганизмов происходит изменение рН среды и окраски индикатора. Интерпретацию результатов осуществляют на основании критериев приведённых в таблицах 2,3.

 

Таблица – 2. Определение МПК антимикробных препаратов методом серийных разведений

 

Номер пробирки	Разведение антибиотика	Концентрация антибиотика мкг/мл	Рост бактерий (помутнение среды)
	1:100		-
	1:200		-
	1:400		-
	1:800	12,5	-
	1:1600	6,25	+
	1:3200	3,12	+
	Среда без антибиотика (контроль)	-	+

 

Таблица – 3. Интерпретация результатов определения чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений.

 

Антибиотик	МПК (мкг/мл)
Чувстви- тельные (S)	Промежу- точные (I)	Устойчи- вые (R)
Пенициллины Бензилпенициллин: · для стафилококков; · для других бактерий.	≤0,12 ≤1,5	- -	>0,25 >1,5
Оксациллин: · для Staphylocoocus aureus; · для других стафилококков.	≤2 ≤0,25	- -	≥4 ≥0,5
Метициллин	≤2	-	>4
Ампициллин: · для стафилококков; · для E. cоli и др. бактерий.	≤0,25 ≤8	-	≥0,5 ≥32
Карбенициллин: · для E. cоli и др. бактерий; · для Pseudomonas aeruginosa.	≤16 ≤128		≥64 ≥512
Пиперрациллин: · для E. cоli и др. бактерий; · для Pseudomonas aeruginosa.	≤16 ≤64	-	≥64 ≥182
Азлоциллин	≤64	-	≥128
Цефалоспорины Цефазолин Цефалотин Цефаклор Цефалексин Цефуроксим Цефамандол Цефотаксим Цефтриаксон Цефоперазон Цефтазидим Цефепим	<8 <8 <8 ≤8 <8 <8 <8 <8 <16 <8 <8	16-32 16-32	>32 >32 >32 ≥32 >32 >32 >64 >64 >64 >32 >32
Новые бета-лактамы Имипенем Меропенем	<4 <4		>16 >16
Хинолоны Налидиксовая кислота Ципрофлоксацин Офлоксацин Норфлоксацин	≤16 ≤4 ≤2 ≤4	-	≥32 ≥4 ≥8 ≥16
Аминогликозиды Канамицин Гентамицин Тобрамицин Амикацин Нетилмицин	≤16 ≤4 ≤4 ≤16 ≤8		≥64 ≥16 ≥16 ≥64 >32
Тетрациклины, макролиды, линкозамиды Тетрациклин Доксициклин Эритромицин Азитромицин Кларитромицин Алендомицин Линкомицин Клиндамицин	≤2 ≤4 ≤0,5 ≤2 ≤2 ≤2 ≤2 ≤0,25	4 – 8 1 – 4   0,5	≥16 ≥16 ≥8 ≥8 ≥8 ≥8 ≥8 ≥1
Антибиотики других групп Хлорамфеникол (левомецитин) Фузидиевая кислота Рифампицин Полимиксин Ванкомицин Фурадонин	≤8 ≤2 ≤2 <50 ЕД/мл ≤4 ≤32	4 – 8   8 – 16	≥32 ≥16 ≥8 ≥50 ЕД/мл ≥32 ≥128

 

Метод серийных разведений в плотных средах

Данный метод определения МИК антибиотика более точен, чем предыдущий. Готовят двукратные разведения антибиотика, после чего вносят по 1 мл каждого разведения в пробирки, содержащие по 4 мл охлаждённого до 45⁰С агара. Процедуру проводят одной пипеткой с перенесением препарата от меньшей концентрации к большей. Содержимое пробирок быстро вносят в чашки Петри до застывания агара. Затем на агар засевают исследуемую культуру микроорганизма и инкубируют 18-20 часов при 37⁰С. После инкубации определяют МИК по отсутствию роста на чашках, содержащих наименьшие концентрации препарата.

 

Диффузионные методы

Метод бумажных дисков

 

Взвесь изучаемой культуры засевают «газоном». Засеянные чашки подсушивают 30-40 минут при комнатной температуре. Затем на поверхность засеянного агара пинцетом накладывают бумажные диски, пропитанные растворами различных антибиотиков. Содержание препарата определяется исходя из терапевтических концентраций каждого антибиотика и средних значений МПК для патогенных бактерий. Название препарата и его количество обозначено на каждом диске. Диски накладывают на равном расстоянии друг от друга и на расстоянии 2 см от края чашки. Одну чашку можно использовать для изучения чувствительности одного штамма к 4-5 антибиотикам.

Засеянные чашки с нанесёнными на них дисками помещают в термостат при 37⁰С на 18-24 ч. Чашки ставят вверх дном, чтобы избежать попадания конденсационной воды на поверхность посевов (рис. 1).

 

 

 

Рисунок - 1. Определение антибиотикочувствительности диско-диффузионным методом.

 

Учет результатов проводят по феномену задержки роста вокруг диска. Диаметр зон задержки роста микробов вокруг дисков определяют с помощью линейки для миллиметровой бумаги, включая диаметр для самого диска. Размеры зон, полученных в опыте, сравнивают с размерами зон задержки роста указанных в инструкциях, прилагаемых к дискам. В зависимости от зоны задержки роста микроорганизмов их относят к чувствительным, умеренно чувствительным или резистентным (таблица 4).

Метод дисков имеет ряд ограничений:

- метод дисков не может быть использован для определения чувствительности к антибиотикам медленно растущих бактерий (Mycobacterium spp., Helicobacter spp., Bacteroides spp., Brucella spp. и др.);

- метод дисков не дает надежных результатов при определении чувствительности бактерий к препаратам, плохо диффундирующим в агар (полимиксин, ристомицин);

- в 30 % случаев чувствительность in vitro не соответствует таковой in vivo.

 

Таблица 4. - Интерпретация результатов определения чувствительности бактерий к антибиотикам методом дисков (на среде АГВ)

 

Антибиотик	Диаметр зоны задержки роста (мм)
Устой- чивые (R)	Промежу- точные (I)	Чувстви- тельные (S)
Пенициллины Бензилпенициллин: · при испытании стафилококков; · при испытании других бактерий.	≤20 ≤10	21 - 28 11-16	≥29 ≥17
Ампициллин: · при испытании стафилококков; · при испытании грамотрицательных бактерий и энтерококков.	≤20   ≤9	21 - 28   10 - 13	≥29   ≥14
Карбенициллин (25 мкг) Карбенициллин (100 мкг) при испытании Pseudomonas aeruginosa	≤14   ≤11	15 – 18   12 - 14	≥19   ≥15
Метициллин	≤13	14 - 18	≥19
Оксациллин (10 мкг)	≤15	16 - 19	≥20
Азлоциллин (для Pseudomonas aeruginosa)	≤13	14 - 16	≥16
Пиперрациллин (для Pseudomonas aeruginosa)	≤17	-	≥18
Азтреонам	≤15	16 - 21	≥22
Цефалоспорины Цефалотин Цефазолин Цефуроксим Цефокситин Цефотаксим Цефтриаксон Цефоперазон Цефтазидим Цефалексин Цефаклор Цефиксим Цефепим*	≤14 ≤14 ≤14 ≤14 ≤14 ≤14 ≤14 ≤14 ≤14 ≤14 ≤15 ≤14	15 – 18 15 – 18 15 – 18 15 – 18 15 – 20 15 – 20 15 – 18 15 – 17 15 – 18 15 – 18 15 – 19 15 – 17	≥19 ≥19 ≥19 ≥19 ≥21 ≥21 ≥19 ≥18 ≥19 ≥19 ≥20 ≥18
Новые бета-лактамы Имипенем* Меропенем*	≤13 ≤13	14 – 15 14 - 15	≥16 ≥16
Хинолоны Ципрофлоксацин Офлоксацин Налидиксовая кислота	≤15 ≤12 ≤12	16 - 20 13 – 16 13 - 17	≥21 ≥17 ≥18
Аминогликозиды Стрептомицин Канамицин Гентамицин Сизомицин Тобрамицин Амикацин Нетилмицин	≤16 ≤14 ≤15 ≤15 ≤14 ≤14 ≤12	17 - 19 15 - 18 - - - 15 - 16 13 - 14	≥20 ≥19 ≥16 ≥16 ≥15 ≥17 ≥15
Тетрациклины, макролиды, линкозамиды Тетрациклин Доксициклин Эритромицин Азитромицин Рокситромицин* Кларитромицин* Линкомицин Клиндамицин Олеандомицин	≤16 ≤15 ≤17 ≤13 ≤14 ≤13 ≤19 ≤14 ≤16	17 – 20 16 - 19 18 – 21 14 - 17 15 - 18 14 - 17 20 - 23 15 – 20 17 - 20	≥22 ≥20 ≥22 ≥18 ≥19 ≥18 ≥24 ≥21 ≥21
Антибиотики других групп Хлорамфеникол (левомецитин) Фузидиевая кислота Рифампицин Полимиксин Ванкомицин: · для стафилококков; · для энтерококков. Ристомицин Фурадонин Фурагин	≤15 ≤16 ≤12 ≤11   ≤11 ≤14 ≤9 ≤15 ≤15	16 - 18 17 –20 13 – 15 12 - 14   - 15 – 16 10 – 11 16 – 18 16 - 18	≥19 ≥21 ≥16 ≥15   ≥12 ≥17 ≥12 ≥19 ≥19

*Предварительные данные

Метод лунок (исходный метод)

 

Готовят чашки Петри и заполняют их питательной средой, слоем 4-5 мм. После застывания агар подсушивают в термостате при 37⁰С в течение 20 минут. Взвесь изучаемой культуры засевают «газоном», излишки микробной взвеси удаляют и еще раз подсушивают в термостате. Затем в агаре пробивают лунки и в каждую лунку вносят по 0,1 мл раствора исследуемого антибиотика. После инкубации в термостате учитывают активность, измеряя диаметр зоны подавления роста для каждого антибиотика.

 

Метод диффузии в агар

 

Подбирают одинакового размера чашки Петри, устанавливают их на горизонтальную поверхность (отрегулированную по ватерпасу), наливают 10 мл стерильного «голодного» агара. После застывания этого слоя на него помещают стерильные цилиндры из стекла или нержавеющей стали (высота 10 мм, внутренний диаметр 6 мм) и заливают их «зараженным» агаром в количестве 15 мл. Для этого растопленный и охлажденный агар добавляют к агаровому смыву суточной культуры бактерии или к смыву полученному из патологического материала. Густоту взвеси определяют по стандарту мутности №5 с последующим разведением до нужного количества микробных клеток в 1 мл. По застывании второго слоя агара цилиндры вынимают и в образовавшиеся лунки вносят испытуемые антибиотики. Мазевые формы вносят в лунку до полного её заполнения. В одной чашке Петри можно испытать активность шести образцов различных препаратов. Посевы инкубируют при температуре 37⁰С в течение 24-48 часов и учитывают результаты. Измеряют зоны задержки роста, видимые вокруг лунок. Высокочувствительные к данному препарату считают микроорганизмы, дающие при его действии зоны задержки роста, превышающие 25 мм, чувствительные - 15-25 мм, малочувствительные -11-15 мм.

 

Метод дорожки по Флемингу

Метод применяется для определения спектра действия антибиотика. В чашке Петри с МПА стерильным скальпелем вырезают дорожку шириной 1 см и удаляют её. Затем в пробирку с растопленным и охлаждённым до 42-45⁰С МПА вносят определённую концентрацию раствора антибиотика. Содержимое пробирки перемешивают и выливают в дорожку так, чтобы жидкость не выходила за её пределы. После застывания агара перпендикулярно к дорожке засевают петлёй культуры нескольких исследуемых микроорганизмов. Посевы инкубируют в термостате 18-24 часа. Затем определяют чувствительность. Чувствительные к препарату микроорганизмы начинают расти лишь на некотором расстоянии от дорожки, нечувствительные растут до самого края.

Е-тест (от англ. Ellipse-эллипс)

Метод определения чувствительности с помощью Е-тестов (Е-test). Последние представляют собой бумажные полоски, пропитанные не одной, а рядом убывающих концентраций определенного антибиотика (512, 256, 128, 64, 32, 16,... мкг/мл). Е-тесты, как и диски при диско-диффузионном методе, укладывают на поверхность стандартного питательного агара, засеянного испытуемой культурой в виде "газона". После инкубирования вокруг полоски формируется эллипсовидная зона задержки роста, сужающаяся в области малых концентраций и "пересекающая" полоску на уровне, соответствующем величине МИК (рис. 2).

 

 

Рисунок - 2. Схема постановки Е-теста (показаны полоски с градиентом концентраций 2-х антибиотиков)