Влияние ингибиторов и активаторов на активность амилазы

Принцип метода. Вещества, усиливающие действие Ферментов, называются активаторами. Вещества с противоположным действием — ингибиторы. Активность амилазы слюны усиливается в присутствии хлористого натрия — специфического активатора амилазы. Сернокислая медь оказывает тормозящее действие на активность амилазы.

Реактивы: слюна в разведении 1:3; крахмал, 1 % раствор; раствор Люголя; хлористый натрий, 1 % раствор; сернокислая медь, 1 % раствор.

Ход работы: В три пробирки приливают по 3 мл раствора слюны в разведении 1:3. В первую пробирку добавляют 1 каплю 1 % раствора хлористого натрия, во вторую — 1 каплю 1% раствора сернокислой меди, в третью — 1 каплю воды. После этого в каждую пробирку приливают по 5 капель 1% раствора крахмала. Все пробирки оставляют при комнатной температуре на 3—5 минут. С содержимым каждой пробирки проделывают реакцию на крахмал, приливая по 1 капле раствора йода в йодистом калии. Записывают результаты опыта и делают выводы.

 

4. Активность α-амилазы слюны (количественное определение).

Принцип метода. Метод основан на определении наименьшего количества амилазы (при максимальном разведении слюны), полностью расщепляющего весь добавленный крахмал. Амилазная активность слюны выражается количеством 0,1% раствора крахмала в миллилитрах, которое расщепляется 1 мл неразведенной слюны при температуре 38°С в течение 30 минут. В норме амилазная активность слюны равна 160—320. Амилазная активность обозначается А 38⁰/30’. Этот метод широко используется для определения амилазной активности крови и мочи.

Реактивы: крахмал 0,1% раствор; раствор Люголя; слюна в разведении 1:9.

Ход работы: В 10 пробирок наливают по 1 мл воды и в первую из них добавляют 1 мл разведенной в 10 раз слюны. Содержимое этой пробирки перемешивают, несколько раз втягивая и выпуская жидкость из пипетки. Набирают в пипетку 1 мл смеси и переносят ее во вторую пробирку. Содержимое этой пробирки перемешивают и 1 мл смеси переносят в третью и т.д. до 10-ой пробирки. Из 10-й пробирки отбирают 1 мл смеси и выливают. Во все пробирки наливают 1 мл воды и по 2 мл 0,1% раствора крахмала, перемешивают, встряхивают пробирки и помещают в термостат при 38⁰С на 30 минут, после инкубации пробирки охлаждают водопроводной водой, добавляют по 1 капле раствора йода и перемешивают. При реакции с йодом жидкость в пробирках окрашивается в желтоватый, розовый и фиолетовый цвет. Отмечают последнюю пробирку с желтоватой окраской, где гидролиз крахмала прошёл полностью. И делают расчёт, полученные данные заносят в таблицу.

 

Номер пробы	Разведение	Окраска раствора с йодом	Выводы
	1:20
	1:40
	1:80
	1:160
	1:320
	1:640
	1:1280
	1:2560
	1:5120
	1:102040

 

Расчёт. Отметив пробирку, где гидролиз крахмала прошёл полностью при наименьшем количестве фермента, по количеству не разведенной слюны в данной пробирке рассчитывают амилазную активность слюны по следующей пропорции:

А мл слюны расщепило 2 мл 0,1% раствора крахмала,

1 мл слюны расщепил Х мл 0,1 % раствора крахмала,

где А – количество неразведенной слюны.

Например, желтоватая окраска появляется в 4-й пробирке, где слюна была разведена в 160 раз; 1/160 мл слюны расщепила 2 мл 0,1% раствора крахмала; 1 мл неразведенной слюны расщепил Х мл 0,1% раствора крахмала: Х=2*1*160/1=320 мл 0,1% раствора крахмала.

Следовательно, амилазная активность слюны А 38⁰/30’ равна 320.

 

Вопросы для самоконтроля:

1. Какие вещества называются ферментами? Каковы их химическая природа и свойства?

2. Что такое специфичность действия ферментов и как она определяется?

3. Как зависит активность ферментов от температуры и величины рН среды?

4. Какие вещества называют активаторами и ингибиторами ферментов? Приведите примеры.

5. Какие качественные и количественные методы используют для изучения действия ферментов?

6. Какую реакцию катализирует амилаза, сахараза?

7. Единицы ферментативной активности. Каким способом выражается активность амилазы в данной работе?

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 7

 

ВИТАМИНЫ.

 

Теоретическая часть.

Витамины — органические низкомолекулярные вещества, имеющие разнообразную химическую природу. Они необходимы организму в очень малых количествах, поступают с пищей и являются незаменимыми факторами питания. При отсутствии витаминов в пище развиваются тяжелые заболевания — авитаминозы, а при недостаточном содержании витаминов — гиповитаминозы (рахит, цинга, бери-бери, пеллагра, анемия и др.).

Функция витаминов в организме связана с обеспечением нормального протекания обменных процессов, поскольку многие из них входят в состав коферментов (простетических групп) ферментов. В составе коферментов находятся водорастворимые витамины; роль жирорастворимых витаминов в процессе обмена веществ изучена в меньшей степени. Витамины не используются как строительный материал клеток и как источник энергии; суточная их потребность измеряется милли- или микрограммами.

Витамины принято подразделять на две большие группы: витамины, растворимые в воде, и витамины, растворимые в жирах и жирорастворителях. К первой группе относятся витамины группы В (витамины В₁, В₂, РР, В₁₂, аминобензойная кислота, пантотеновая, фолиевая кислоты, биотин), витамины С и Р. К жирорастворимым витаминам относятся А, Д, Е, К. Многие витамины содержатся в продуктах животного происхождения и поступают в организм в виде провитаминов, являющихся исходными продуктами для образования витаминов. Некоторые витамины способны синтезироваться микрофлорой кишечника человека или в организме, например витамин РР — из аминокислоты триптофана. Введение отдельных лекарственных веществ может отрицательно сказаться на синтезе витаминов микрофлорой кишечника. Суточная потребность в витаминах возрастает при различных заболеваниях, беременности, лактации и при нарушении всасывания жирорастворимых витаминов в случае недостаточного поступления желчи в кишечник при заболевании печени.

Структурные аналоги витаминов, близкие к ним по строению, называют антивитаминами. Эти вещества встречаются в природе или могут быть синтезированы. Антивитамины способны соединяться с белковой частью фермента вместо витаминов и вызывать изменения активности ферментов и обменных процессов.

Для обнаружения витаминов в различных веществах или в биологических жидкостях и определения их количества существуют качественные реакции, основанные на цветных реакциях, характерных для той или иной другой группировки, входящей в витамин.

 

Практическая часть.

1. Качественная реакция на витамин В₂.

Рибофлавин состоит из изоаллоксазинового ядра и спирта рибитола:

 

 

Рибофлавин входит в состав простетической группы флавиновых ферментов — флавопротеидов в виде коферментов флавинадениндинуклеотида (ФАД) и флавинаденинмононуклеотида (ФМН). Флавопротеиды активируют реакции дегидрирования, т. е. отщепления протонов и электронов от субстратов. Они участвуют в окислении D-аминокислот, оксикетокислот, НАДН (Н+), в биологическом окислении и др. Биологическое действие флавиновых ферментов связано с наличием в изоаллоксазиновом кольце двойных связей: флавиновый фермент отнимает от окисляемой молекулы два электрона, присоединяя их к азоту по месту двойных связей, и два протона. При недостатке в организме витамина В₂ могут возникнуть, например, катаракта (помутнение хрусталика) и другие заболевания.

Принцип метода. Окисленная форма витамина В₂ представляет собой желтое флюоресцирующее в ультрафиолетовых лучах вещество. Реакция на витании В₂ основана на способности его легко восстанавливаться; при этом раствор витамина В₂, обладающий желтой окраской, приобретает сначала розовый цвет за счет образования промежуточных соединений, а затем обесцвечивается, так как восстановленная форма витамина В₂ бесцветна.

 

Реактивы: хлористоводородная кислота концентрированная; цинк металлический; витамин В₂, 0,025% раствор (перед определением раствор можно развести в 5 раз).

Ход работы: В пробирку наливают 10 капель раствора витамина В₂, добавляют 5 капель концентрированной хлористоводородной кислоты и опускают зернышко металлического цинка. Начинается выделение пузырьков водорода, жидкость постепенно розовеет, затем обесцвечивается.