Принцип метода. Каталитическая активность ферментов зависит от рН среды. С изменением величины рН меняется структура фермента. Для каждого фермента характерен определенный оптимум рН. От рН зависит степень ионизации фермента.
 |
Зависимость ферментативной активности от рН среды изучается в работе на примере α— амилазы, субстратом которой является крахмал (полисахарид, состоящий из глюкозы). Фермент α- амилаза (α-1,4-глюкан-4-глюканогидролаза) содержится в слюне и катализирует гидролиз α- глюказидной связи α-1,4-крахмала и гликогена до дисахарида мальтозы. Кроме того, в слюне имеется Фермент мальтаза, расщепляющая мальтозу до глюкозы.
 |
крахмал декстрины мальтоза
Гидролиз крахмала под действием α- амилазы проходит до стадии образования декстринов. Нерасщепленный крахмал с йодом дает синее окрашивание, декстрины в зависимости от размера дают с йодом окрашивание: амилодекстрины — фиолетовое, эритродекстрины — красно-бурое, ахродекстрины и мальтоза — желтое (цвет йода в воде, т.е. окрашивание с йодом не дают). Конечные продукты гидролиза крахмала — мальтоза и глюкоза — имеют свободные альдегидные группы и могут быть обнаружены реакцией Троммера, в основе которой лежит окислительно—восстановительная реакция. При этом альдегидная группа окисляется до глюконовой кислоты, а медь — гидрат окиси меди (голубого цвета) восстанавливается в гидрат закиси меди желтого цвета. При дальнейшем нагревании гидрат закиси меди переходит в красную закись меди.
 |
Реактивы: амилаза слюны (прополаскивают рот, затем набирают 10—15 мл дистиллированной воды и держат ее во рту в течение минуты, после чего сливают в стаканчик); крахмал, 0,1 % раствор на 0,3 % растворе хлорида натрия; раствор Люголя; едкий натр, 0,1 Н раствор; HCl, 0,1 Н раствор.
Ход работы: Активность амилазы слюны неодинакова у разных людей и даже меняется в течение дня у одного и того же человека. Поэтому необходимо подобрать подходящее разведение раствора слюны так, чтобы гидролиз 1 мл раствора крахмала при комнатной температуре и нейтральной реакции среды под влиянием 1 мл раствора слюны проходил на 5—8 минут. Для этого в пробирке смешивают 1 мл раствора крахмала и 1 мл раствора слюны. Сразу же после смешивания каплю смеси помешают в чистую пробирку, добавляют каплю раствора Люголя и отмечают окраску. В дальнейшем пробы берут с интервалом в полминуты. Реакция считается законченной, когда цвет раствора Люголя не изменяется. Если гидролиз крахмала происходит быстро, то слюну разводят и снова определяют время расщепления крахмала. Если гидролиз крахмала идет медленнее, чем 10 минут, то к раствору фермента добавляют несколько капель неразведенной слюны и определяют время полного гидролиза крахмала. После подбора нужной активности фермента выполняют основную часть работы по изучению влияния реакции среды на активность амилазы.
Схему построения опыта и получение результатов записывают в таблицу:
| пробы | НС1 0,1н; мл | NaOH 0,1н; мл | H2O мл | рН | Крахмал мл | Фермент мл | реакция с йодом |
| 0,5 | - | 1,5 | Кислая | ||||
| - | - | 2,0 | Нейтральная 6,9-7,0 | ||||
| - | 0,5 | 1,5 | Щелочная |
Так как оптимум рН для амилазы слюны равен 6,9 –7,0, наблюдение за гидролизом крахмала ведут по пробе № 2 и добавляют раствор Люголя. Как только гидролиз во второй пробе закончится, опыт прекращают добавлением во все три пробы 2-3 капли раствора Люголя.
Пробу № 3 перед добавлением раствора Люголя нейтрализуют 0,1н раствором соляной кислоты, так как в щелочной среде реакция с йодом не идет.
Наблюдают отсутствие реакции с йодом во второй пробе и фиксируют оттенок в первой и третьей пробах. Результаты записывают в таблицу, делают выводы о влиянии реакции среды на активность амилазы.
