Работа № 1. Определение липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) в сыворотке крови

ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ. ЛПНП (β-липопротеины) содержат в своем составе 40% холестерина, транспортируют этот стероид в сыворотке крови. Количество ЛПНП изменяется при нарушении метаболизма холестерина в организме.

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЙ МЕХАНИЗМ МЕТОДА. ЛПНП образуют с гепарином комплекс, который при добавлении хлорида кальция выпадает в осадок. Степень помутнения раствора пропорциональна содержанию ЛПНП в сыворотке крови и определяется нефелометрически.

ХОД РАБОТЫ: взять одну пробирку.

ПРОБА отмерить	ОПЫТ
Раствор СаСl₂ 0,27 % Сыворотка крови Гепарин, 1 %	2 мл 0,2 мл Перемешать. ФЭК, λ = 630 нм, кювета 5 мм, определить Е₁ против Н₂О. Перелить раствор в пробирку. 0,04 мл Перемешать. Инкубация ровно 4 минуты Определить в тех же условиях Е₂ против Н₂О.
РЕЗУЛЬТАТ: Е₁ =; Е₂ =. РАСЧЕТ: концентрация ЛПНП = (Е₂ – Е₁)·100 = г/л. КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ. Нормальное содержание ЛПНП в сыворотке крови: 2 - 4 г/л. Увеличение концентрации ЛПНП наблюдается при атеросклерозе, сахарном диабете, гипотиреозе, механической желтухе, острых гепатитах, хронических заболеваниях печени, ожирении, гиперкортицизме, гиперлипопротеинемии II типа.

ВЫВОД:

Дата ______________

ЗАНЯТИЕ № 27

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ АУДИТОРНАЯ РАБОТА

ПО ТЕМЕ «ОБМЕН И ФУНКЦИИ ЛИПИДОВ»

Задания для самостоятельной работы:

1. Составить метаболическую карту липидного обмена.

2. На карте отметить:

2.1. Диагностически значимые субстраты (общие липиды, три-ацилглицеролы, холестерол, липопротеины, кетоновые тела).

2.2. Ферменты, исследуемые с целью диагностики (липаза, липопротеинлипаза).

2.3. Регуляторные ферменты β-окисления, синтеза жирных

кислот и холестерола, липолиза.

2.4. Витаминзависимые ферменты.

3. Решение и обсуждение ситуационных задач.

Дата: _______________

ЗАНЯТИЕ № 29

РАБОТА № 26. АКТИВНОСТЬ АЛАНИНАМИНО-ТРАНСФЕРАЗЫ (АлАТ) В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ. Аминотрансферазы - ферменты, катализирующие перенос аминогруппы с аминокислот на кетокислоты. В качестве кофермента ферменты содержат производное витамина В₆ - пиридоксальфосфат и пиридоксаминфосфат. Активность аминотрансфераз отражает состояние аминокислотного обмена в печени, сердечной мышце, почках, скелетной мускулатуре и других органах.

ПРИНЦИП МЕТОДА: аланинаминотрансфераза катализирует реакцию:

АлАТ В₆

глутаминовая кислота

аланин + 2-кетоглутаровая + пировиноградная

кислота кислота

При добавлении кислого 2,4-динитрофенилгидразина ферментативный процесс останавливается и образуется динитрофенилгидразон пирувата:

Это соединение в щелочной среде дает коричнево-красное окрашивание. Интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству образовавшейся пировиноградной кислоты. По количеству пировиноградной кислоты судят об активности фермента (метод Райтмана-Френкеля).

ХОД РАБОТЫ: взять две пробирки.

ПРОБА отмерить	О П Ы Т	КОНТРОЛЬ
СУБСТРАТ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЙ РАСТВОР СЫВОРОТКА КРОВИ	0,25 мл -- 0,05 мл	0,25 мл 0,05 мл --
Инкубируют в термостате 30 минут при 37^оС
2,4-Динитрофенилгидразин	0,25 мл	0,25 мл

Перемешать, оставить на 20 минут при комнатной температуре.

NaOH

2,5 мл

Перемешать и через 10 минут измерить экстинкцию опыта на колориметре против контрольного раствора.

Длина волны 500-530 нм; кювета 5 мм.

РЕЗУЛЬТАТ: D Е =;

По калибровочному графику активность аланинаминотрансферазы составляет ………….. ммоль/ч×л.

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.

Активность аланинаминотрансферазы в сыворотке крови у взрослых в норме: 0,1 - 0,68 ммоль/ч×л, у новорожденных 0,06 – 0,27 ммоль/ч×л, у детей 2-14 лет 0,09 – 0,64 ммоль/ч×л.

Повышение активности фермента наблюдается при некрозе клеток печени любой этиологии, вирусных и хронических гепатитах, механической желтухе, травмах мышц, миозите, миокардите, инфаркте миокарда, дистрофии, миопатии.

ВЫВОД:

Дата: _______________

ЗАНЯТИЕ № 30