Колориметрическим методом определяют концентрацию веществ в окрашенных прозрачных растворах по интенсивности окраски раствора. В основу колориметрического метода анализа положен закон Ламберта-Бугера-Бера: поглощение света прямо пропорционально концентрации вещества в растворе и зависит от толщины слоя (толщины кювет, d). В фотометрии используют монохроматический свет (свет определенной длины волны, l).
Принципиальная схема устройства фотоэлектроколориметра
Расчет концентрации вещества
1) по формуле (с использованием стандартного раствора, с известной концентрацией вещества);
где Со – концентрация опытной пробы;
Ео – экстинкция опытной пробы;
Сст - концентрация стандартной пробы;
Ест - экстинкция пробы со стандартным раствором.
2) по калибровочному графику, который строят, используя стандартные растворы, содержащие различные известные концентрации вещества и сопутствующие им показания оптической плотности.
Дата: ________________
ЗАНЯТИЕ № 2
РАБОТА № 1. ЦВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ И АМИНОКИСЛОТЫ
Обоснование выполнения работы. Цветные реакции на белки и аминокислоты позволяют обнаружить присутствие белка в биологических жидкостях, установить аминокислотный состав. Эти реакции применяют как для качественного, так и для количественного определения белков и аминокислот.
1. Биуретовая реакция на белки
Принцип метода. Раствор белка в щелочной среде в присутствии сульфата меди (NaOH/CuSO4) окрашивается в сине-фиолетовый цвет. Окраска обусловлена образованием комплексного соединения ионов меди с пептидными группами белка, которых должно быть не менее двух. Таким образом, эта реакция открывает все белки, а также низкомолекулярные пептиды.
Ход работы: взять опытную пробирку.
| ОТМЕРИТЬ | О П Ы Т |
| Раствор белка NaOH, 10 % CuSO4, 1 % | 5 капель 5 капель 2 капли |
РЕЗУЛЬТАТ:
В Ы В О Д:
2. Нингидриновая реакция
Принцип метода: аминокислоты, пептиды и белки при кипячении с раствором нингидрина дают синее окрашивание (комплекс Руэмана). Реакция характерна для аминогрупп, находящихся в альфа-положении.
СО2
АМИНОКИСЛОТА + НИНГИДРИН ® ШИФФОВО ОСНОВАНИЕ
АЛЬДЕГИД
 |
АМИНОДИКЕТОГИДРИНДЕН + НИНГИДРИН КОМПЛЕКС РУЭМАНА (СИНЕ-ФИОЛЕТОВОГО ЦВЕТА)
Ход работы: взять опытную пробирку.
| ОТМЕРИТЬ | О П Ы Т |
| Раствор белка Нингидрин 0,5 % | 5 капель 5 капель |
| Кипятить до появления окраски |
РЕЗУЛЬТАТ:
В Ы В О Д:
1. Ксантопротеиновая реакция Мульдера
(на ароматические аминокислоты)
NO2
t° 100°C
HO― ―CH2―CH―COOH + 2HNO3 →HO― CH2―CH―COOH
│ │
NH2 NO2 NH2
тирозин динитротирозин
Принцип метода. Ароматические аминокислоты (фенилаланин, тирозин, триптофан) при нагревании с азотной кислотой нитруются. Это проявляется развитием желтого окрашивания.
Ход работы: взять опытную пробирку.
| ОТМЕРИТЬ | О П Ы Т |
| раствор белка HNO3 концентрированная | 5 капель 5 капель |
| Кипятить до появления окраски |
РЕЗУЛЬТАТ:
В Ы В О Д:
4. Реакция Фоля на цистеин
Принцип метода. Реакция характерна для слабосвязанной серы в составе аминокислоты цистеин. Конечный продукт – сульфид свинца – черного цвета.
2Н2О
ЦИСТЕИН + 4NaOH + (СН3СОО)2 Рb СЕРИН + РbS + 4NaOH + +2CH3COOH ацетат свинца сульфид
свинца
Ход работы: взять пробирку.
| ОТМЕРИТЬ | О П Ы Т |
| Раствор белка NaOH, 30 % Раствор (СН3СОО)2 Рb 5 % | 5 капель 5 капель 1 каплю |
| Кипятить до появления окраски. |
РЕЗУЛЬТАТ:
В Ы В О Д:
РАБОТА № 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО БЕЛКА ПЛАЗМЫ БИУРЕТОВЫМ МЕТОДОМ
Принцип метода. БЕЛОК + NaOH/CuSO4 = сине-фиолетовый цвет, интенсивность окраски раствора прямо пропорциональна концентрации белка в сыворотке и определяется фотометрически.
Ход работы: взять две пробирки: контрольную и опытную.
| ОТМЕРИТЬ | КОНТРОЛЬ | О П Ы Т |
| Реактив Горнала сыворотка NaCl 0,9 % | 4,0 мл - 0,1 мл | 4,0 мл 0,1 мл - |
| Перемешать, фотометрия через 20 минут. Кювета 10 мм, l = 540 нм (зеленый светофильтр) |
РЕЗУЛЬТАТ: измерение на колориметре проводят против контрольной пробы и отмечают экстинцию. Eоп =
Конечный результат: определяют по калибровочному графику.
Cоп = г/л
КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.
Нормальное содержание общего белка (общий белок крови = альбумины + глобулины + фибриноген) в сыворотке крови у взрослых - 65-85 г/л, у новорожденных 47-65 г/л, у детей 2-14 лет 62-80 г/л.
Повышение концентрации общего белка сыворотки крови (гиперпротеинемия) характерно для: ревматоидного артрита, коллагенозов, бронхоэктатической болезни, миеломной болезни, гипериммуноглобулинемии, а также гипогидратации организма (рвота, понос) и венозного стаза;
Снижение концентрации белка в сыворотке крови (гипопротеинемия) отмечается при: голодании, беременности, нефротическом синдроме (гломерулонефрит), хронических заболеваниях печени (гепатиты и циррозы), гастроэнтеропатиях, ожогах, раковой кахексии.
ВЫВОД:
Дата: ________________
ЗАНЯТИЕ № 3
РАБОТА № 1. ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ КОНЦЕНТРИРОВАННЫМИ МИНЕРАЛЬНЫМИ КИСЛОТАМИ
Обоснование выполнения работы: демонстрируют влияние химических факторов на устойчивость белков в растворах.
Принцип метода: белок осаждается вследствие химической денатурации белка и образования комплексной соли белка с кислотами.
Ход работы: взять опытную пробирку.
| ОТМЕРИТЬ | ОПЫТ |
| HNO3 концентрированная Раствор белка | 10 капель - 10 капель |
Наклонив пробирки под углом 45о, осторожно по стенке пробирки приливают раствор белка так, чтобы обе жидкости не смешивались.
РЕЗУЛЬТАТ:
В Ы В О Д:
РАБОТА № 2. РАЗДЕЛЕНИЕ АЛЬБУМИНОВ И ГЛОБУЛИНОВ ЯИЧНОГО БЕЛКА МЕТОДОМ ВЫСАЛИВАНИЯ
Обоснование выполнения работы. Высаливанием обратимо осаждают белки, фракционируют их. Используют для выделения белков, в том числе ферментов.
Принцип метода. При высаливании происходит дегидратация макромолекул белка и устранение заряда. Осаждение белка обратимо и зависит от молекулярной массы белка и дегидратирующей способности растворов нейтральных солей.
Ход работы: взять две пробирки (опыт 1 и опыт 2).
| ОТМЕРИТЬ | ОПЫТ 1 | ОПЫТ 2 |
| Раствор белка NaCl (порошок) (NH4)2SO4 насыщенный раствор (100 %) | 1,0 мл до насыщения (100%) - Отставить на 10 минут | 1,0 мл - 1,0 мл (получится 50% раствор) Без инкубации |
| Р Е З У Л Ь Т А Т: | ||
| Отфильтровать | Отфильтровать | |
| (NH4)2 SO4 (порошок) | Прокипятить | Добавить соль до насыщения |
| Р Е З У Л Ь Т А Т: |
В Ы В О Д:
Дата: _______________
ЗАНЯТИЕ № 4
РАБОТА № 1. КИСЛОТНЫЙ ГИДРОЛИЗ БЕЛКОВ
Обоснование выполнения работы. Гидролиз белка – это расщепление биополимера с присоединением воды по месту разрыва пептидных связей под действием кислот, оснований или протеаз. Последовательность гидролиза белка показана на схеме.
В лабораторных условиях гидролиз белков используется для определения первичной структуры, аминокислотного состава белков. Гидролизаты белков применяются в качестве лечебных препаратов при парентеральном питании. В организме человека и животных постоянно происходит гидролиз белков в пищеварительном тракте и клетках органов под действием протеолитических ферментов.
Принцип метода. Большинство биополимеров в реакциях с водой распадаются на мономеры. Гидролиз катализируют протоны, ионы гидроксила и ферменты по механизму нуклеофильного замещения у углерода с карбонильной группой. Полный кислотный гидролиз белков при кипячении происходит в течение 12-96 часов.
Ход работы:
1. В химическую колбу внести 20 мл раствора яичного белка.
¯
2. Добавить 5 мл концентрированной НCl.
¯
3. Отлить 0,5 – 1 мл смеси в пробирку (№ 1), (5 капель).
¯
4. Колбу закрыть резиновой пробкой с длинной стеклянной трубкой (обратный холодильник).
¯
5. Содержимое колбы кипятить под вытяжкой в течение 45 минут.
¯
6. После охлаждения отлить 0,5 – 1 мл гидролизата в пробирку (№ 2) (5 капель).
¯
7. Нейтрализовать содержимое пробирок 20 % NaOH по лакмусу до голубой окраски.
¯
8. Провести биуретовую реакцию в пробирках № 1 и № 2.
РЕЗУЛЬТАТ:
В Ы В О Д:
РАБОТА № 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ТРИПСИНА
Обоснование выполнения работы. Протеолитический фермент трипсин осуществляет расщепление пищевых белков в содержимом двенадцатиперстной кишки в верхних отделах тонкого кишечника. Фермент используется также для расщепления белков в лабораторных условиях.
Принцип метода. Протеолитическая активность трипсина регистрируется по количеству освобождающегося аргинина и лизина, которые с фенольным реактивом дают синюю окраску, измеряемую колориметрически.
Ход работы: взять две центрифужные пробирки: контрольную и опытную.
| ОТМЕРИТЬ | КОНТРОЛЬ | О П Ы Т |
| Раствор белка Фосфатный буфер рН 8,0 ТХУ, 10 % Раствор трипсина | 0,5 мл 1,0 мл 2,0 мл 0,5 мл | 0,5 мл 1,0 мл - 0,5 мл |
| Инкубация 20 минут, при 37оС в термостате | ||
| ТХУ, 10 % | 2 мл | |
| Центрифугирование 10 минут, 1500 об/мин. Центрифугат перелить в сухие пробирки. | ||
| раствор NaOH 0,5 М фенольный реактив | 5,0 мл 0,5 мл | 5,0 мл 0,5 мл |
| Размешать. Инкубация 20 минут при 18оС |
РЕЗУЛЬТАТ:
В Ы В О Д:
Дата: _______________
ЗАНЯТИЕ № 5
РАБОТА № 1. ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА АКТИВНОСТЬ АМИЛАЗЫ
ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ. Позволяет охарактеризовать одно из свойств ферментов – зависимость протекания ферментативных реакций от температуры (термолабильность).
Принцип метода:
амилаза амилаза
Крахмал ® декстрины ® мальтоза.
Крахмал дает с иодом синий цвет.
Декстрины дают с иодом фиолетовое, красно-бурое окрашивание.
Мальтоза – желтый (цвет иода в воде).
ХОД РАБОТЫ: взять три пробирки, опыт 1-3. Развести слюну 1: 10 (1мл слюны в отдельной пробирке + 9 мл Н2О).
| ОТМЕРИТЬ | ОПЫТ-1 | ОПЫТ-2 | ОПЫТ-3 |
| Крахмал 1 % Амилаза слюны (разведение 1:10) | 0,5 мл 0,5 мл | 0,5 мл 0,5 мл | 0,5 мл 0,5 мл |
| Поместить пробирки на 10 минут | Комнатная температура (20оС) | Термостат (40оС) | Кипящая водяная баня (100оС) |
| Через 10 минут во все пробирки добавить по 1-2 капли KJ 1% |
РЕЗУЛЬТАТ:
ВЫВОД:
РАБОТА № 2. ВЛИЯНИЕ АКТИВАТОРОВ И ИНГИБИТОРОВ НА АКТИВНОСТЬ АМИЛАЗЫ СЛЮНЫ
ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ. Активаторы и ингибиторы регулируют действие ферментов. Эти сведения используют для изучения влияния ксенобиотиков и изучения воздействия на энзимы изменяющихся концентраций нормальных метаболитов клетки.
Принцип метода. При активации идет конформационная перестройка активного центра фермента и увеличивается скорость реакции. Ингибиторы оказывают противоположное действие (механизмы различны: через аллостерический центр, путем ковалентного связывания, денатурации и т.д.).
ХОД РАБОТЫ: взять три пробирки: контрольную и две опытные.
| ОТМЕРИТЬ | КОНТРОЛЬ | ОПЫТ 1 | ОПЫТ 2 |
| Н2О NaCl 1 % CuSO4 1 % Амилаза слюны (1: 10) Крахмал 1% | 10 капель - - 20 капель 5 капель | 8 капель 2 капли - 20 капель 5 капель | 8 капель - 2 капли 20 капель 5 капель |
¯
Пробирки оставить при комнатной температуре на 5 минут
(10, 15 минут).
¯
Добавить по 2-3 капли раствора йода во все пробирки.
РЕЗУЛЬТАТ:
ВЫВОД:
РАБОТА № 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АМИЛАЗЫ (ДИАСТАЗЫ) В СЫВОРОТКЕ КРОВИ И МОЧЕ
ПО МЕТОДУ КАРАВЕЯ
ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ. Определение активности амилазы в моче и сыворотке крови используют для диагностики заболеваний поджелудочной железы.
Принцип метода. Метод основан на колориметрическом определении концентрации крахмального субстрата до и после его ферментативного гидролиза. В качестве рабочего раствора используется 0,01 н. раствор йода.
ХОД РАБОТЫ:
Длина волны 630-690 нм (красный светофильтр), кювета с толщиной слоя 1 см.
В 2-х пробирках (опытной и контрольной) проводят анализ согласно таблице:
| КОМПОНЕНТЫ | ОПЫТНАЯ ПРОБА | КОНТРОЛЬНАЯ ПРОБА |
| Раствор стойкого крахмального субстрата | 0,5 мл | 0,5 мл |
| прогреть 5 мин в водяном термостате при 37°С | ||
| Негемолизированная сыворотка крови | 0,01мл | - |
| прогреть 5 мин в водяном термостате при 37°С | ||
| Рабочий раствор йода (0,01 н.) | 0,5 мл | 0,5 мл |
| Дистиллированная вода | 4 мл | 4 мл |
| Негемолизированная сыворотка крови | - | 0,01 мл |
| пробирки встряхивают, и растворы фотометрируют относительно воды |
РАСЧЕТЫ. Расчет активности α-амилазы в г расщепленного крахмала на 1 л сыворотки за 1 час инкубации при 37°С производят по формуле:
Ек – Еоп
Х = × 240
Ек
Ек – экстинкция контрольной пробы;
Еоп – экстинкция опытной пробы.
РЕЗУЛЬТАТ:
КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.
Активность α-амилазы в сыворотке крови в норме = 16-30 г/час×л, в моче – 28-160 г/час×л.
Повышение активности фермента наблюдается при паротите, панкреатите, раке поджелудочной железы, перитоните, циррозе печени, остром инфекционном гепатите, внематочной беременности, диабетическом кетоацидозе.
Снижение активности α-амилазы отмечается при атрофии поджелудочной железы, нарушении фильтрационной функции почек, кахексии.
ВЫВОД:
Дата: _______________
ЗАНЯТИЕ № 6
