Экспресс-метод определения повышенного содержания фенилаланина в плазме крови

Превращение незаменимой аминокислоты фенилаланина в заменимую – тирозин в организме человека осуществляется реакцией гидроксилирования, которую катализирует фермент фенилаланин-4-монооксигеназа (косубстратом служит тетрагидробиоптерин).

Врожденное отсутствие фенилаланин-4-монооксигеназы приводит к развитию тяжелого наследственного заболевания - фенилпировиноградной олигофрении (фенилкетонурии).

При этом, вследствие уменьшения потребления фенилаланина тканями, его концентрация в плазме крови резко возрастает (в норме содержание 0,1 ммоль/л, что соответствует 0,015 г/л).

Одновременно, в результате усиления реакции трансаминирования фенилаланина, в тканях повышается концентрация фенилпирувата – конкурентного ингибитора ферментов, участвующих в метаболизме пирувата. У ребенка наблюдается замедление умственного развития и развивается фенилпировиноградная олигофрения. В связи с этим чрезвычайно важно провести как можно более раннюю диагностику данной патологии (на 1-3 день рождения ребенка) и ввести строгую диету, исключающую фенилаланин из питания. Для раннего выявления отсутствия фенилаланин-4-монооксигеназы проводят определение повышенного содержания фенилаланина в плазме крови, которое довольно просто осуществить методом бумажной хроматографии.

Цель работы

Оценить методом бумажной хроматографии содержание фенилаланина в плазме крови обследуемого ребенка по сравнению с заведомо здоровым.

Принцип метода

Хроматографическое разделение образцов плазмы крови обследуемого ребенка и заведомо здорового в сравнении со стандартом, содержащем предельно допустимое количество фенилаланина (полуколичественное исследование).

Выполнение работы

Берут 3 диска хроматографической бумаги диаметром 12 см.

На I диск наносят 2 мкл плазмы крови обследуемого ребенка. На II диск – 2 мкл плазмы крови заведомо здорового ребенка (концентрация фенилаланина 0,015 г/л). На III диск – 2 мкл стандартного раствора фенилаланина (концентрация 0,06 г/л) и 2 мкл плазмы крови здорового ребенка. Общая концентрация фенилаланина 0,075 г/л.

Нанесение растворов на хроматографические диски, проведение хроматографии и проявление хроматограмм проводят так же, как в предыдущей работе «Доказательство проявления активности АлАТ методом бумажной хроматографии».

Сравнивают полученные хроматограммы по интенсивности окраски фенилаланина на всех трех дисках и делают вывод о содержании фенилаланина в плазме крови обследуемого ребёнка.

Выводы

Тестовые задания по теме: «Обмен аминокислот»

1) Ответить на каждый вопрос однозначно: «да» или «нет»

1. Гистидин в печени способен дезаминироваться по внутримолекулярному типу.

2. Восстановленные коферменты оксидаз аминокислот могут непосредственно окисляться молекулярным кислородом.

3. Дезаминирование глутаминовой кислоты сопровождается промежуточным образованием иминокислоты.

4. Коферментом моноаминоксидаз (МАО) служит ФАД.

5. Декарбоксилирование аминокислот является необратимым процессом.

6. Аммиак образуется при любом типе дезаминирования аминокислот.

7. Обладает ли гистамин сосудосуживающим действием?

8. Является ли дофамин предшественником норадреналина?

9. Возможно ли декарбоксилирование 5-окситриптофана в организме человека?

10. Все ли природные аминокислоты могут "сгорать" в ЦТК?

11. Может ли из аланина образоваться глюкоза в организме человека?

12. Относится ли лейцин к кетогенным аминокислотам?

2) Выбрать один правильный ответ

Коферментом большинства декарбоксилаз аминокислот является: 1. ФАД 2. ФМН 3. ПФ 4. ТПФ 5. НАДФ

Декарбоксилирование аминокислот приводит к образованию: 1. спирта 2. альдегида 3. амина 4. амида 5. кетона

3) Установить соответствие фермента, участвующего в обмене АМК, и соответствующего кофермента

1. аминотрансферазы 2. глутаматдегидрогеназа 3. моноаминооксидазы 4. сериноксиметилтрансфераза

А. ТГФК Б. ФАД В. НАД ⁺ Г. ПФ

6.5. Количественное определение мочевины в моче ферментативным уреазным/фенол-гипохлоритным методом

Мочевина – основной конечный продукт обмена белков в организме человека. На долю мочевины приходится 80-90% выделяемого с мочой азота.

Биологическая роль синтеза мочевины в печени (орнитиновый цикл мочевинообразования Кребса) заключается в связывании образующегося при дезаминировании аминокислот аммиака в относительно малотоксичную молекулу мочевины, которая затем экскретируется с мочой.

Зная количество экскретируемой за сутки мочевины и количество азота, поступающего с пищей, можно вычислить азотистый баланс, который является важным показателем состояния белкового и аминокислотного обмена. Азотистый баланс может быть:

1) положительным – у детей, у выздоравливающих после тяжелой болезни;

2) отрицательным – при тяжелых заболеваниях, в том числе онкологических, при голодании и в старческом возрасте;

3) равным нулю (азотистое равновесие) – у здоровых взрослых людей (при нормальном питании).

Всякое повышение белкового обмена, процессы интенсивного распада белка (опухоли, гипертиреоз, диабет) сопровождаются усилением мочевинообразования и увеличением количества мочевины, выделяемой с мочой за стуки. Патологические изменения печени, приводящие к ее функциональной недостаточности, а, следовательно, нарушению синтеза мочевины, сопровождаются понижением количества мочевины в крови и моче. Функциональная недостаточность почек ведет к понижению количества мочевины в моче и одновременному повышению ее содержания в крови (уремия). Некоторые формы диабета, характеризующиеся повышенным аппетитом и прогрессирующим исхуданием больного, сопровождаются повышением выделения мочевины с мочой за счет усиленного распада белков.

Цель работы

Определить содержание мочевины в суточной моче и сравнить с нормой.

Принцип метода

Метод – ферментативный, основан на реакции расщепления молекулы мочевины под действием высокоспецифического фермента – уреазы – до аммиака и углекислого газа, которые в водном растворе образуют карбонат аммония.

Ионы аммония в присутствии нитропруссида натрия реагируют с фенолом и гипохлоритом натрия. В результате реакции образуется индофенол (синего цвета), интенсивность окрашивания которого пропорциональна концентрации ионов аммония (и, соответственно, мочевины).

Выполнение работы (см. приложение)

Для исследования берут следующие пробы (3 промаркированные пробирки): опыт (разведенная моча), стандарт (стандартный раствор мочевины 0,03 г/л) и контроль (вода). Все реактивы вносят, согласно описанию в таблице:

Реактивы и этапы	Опыт	Стандарт	Контроль
Моча 1:1000, мл	0,1	—	—
Стандарт 0,03 г/л, мл	—	0,1	—
Вода дистиллированная, мл	—	—	0,1
Раствор уреазы, мл	0,1	0,1	0,1
Перемешивают. Инкубируют 5 минут при 20°С.
Фенол + нитропруссид натрия, мл	1,0	1,0	1,0
Щелочной раствор гипохлорита натрия, мл	1,0	1,0	1,0
Вода дистиллированная (мл)	1,0	1,0	1,0
Перемешивают. Инкубируют 15 минут при 37°С.
Фотометрируют против Н₂О (l = 540 нм, толщина кюветы 0,5 см). D₅₄₀
Dоп - Dк
Dст - Dк

На студенческую группу ставят 2 контроля и 2 стандарта. Остальные студенты делают опытные пробы.

Расчет по стандарту мочевины [***]

m(мочевины) = г (за сутки)

Зная массовую долю (w) азота в мочевине, w(N) = = 0,47

(где 60 – относительная молекулярная масса мочевины (Mr); 14 – относительная атомная масса азота), можно рассчитать массу азота мочевины за сутки:

m(N) = m(мочевины) ∙ 0,47 г (за сутки)

Норма: масса азота – 12-17 г/сутки

масса мочевины – 25-35 г/сутки

Выводы

Тестовые задания по теме: «Пути обезвреживания аммиака в организме человека и животных»

1) Ответить на каждый вопрос однозначно: «да» или «нет»

1. Глутаминсинтетаза относится к классу лигаз.

2. Выведение мочевины с мочой в количестве 20 - 35 мг/сутки является нормой.

3. Образование карбамоилфосфата в синтезе мочевины требует затраты двух молекул АТФ.

4. Креатин в норме выводится с мочой.

5. Аргиназа катализирует образование оксида азота.

6. Аминогруппа аспартата служит одним из источников азота в молекуле мочевины.

7. Являются ли аминокислоты единственным источником аммиака в организме?

8. Может ли азот амидной группы глутамина включаться в молекулу мочевины?

9. Расходуется ли АТФ в глутаминсинтетазной реакции?

10. Нормально ли для человека выделение 1г креатинина за сутки?

11. Участвует ли метионин в синтезе креатина?

12. Выводится ли ион аммония с мочой?

2) Выбрать один правильный ответ

Аммиак в клетках мозга обезвреживается путем: 1. синтеза мочевины 2. образования солей аммония 3. превращения глутамата в глутамин 4. синтеза креатина 5. всеми перечисленными способами Цикл мочевинообразования происходит в: 1. почках 2. печени 3. надпочечниках 4. мочевом пузыре 5. поджелудочной железе

3) Установить соответствие Х (цифра) и Y (буква)

Y

Х мочевина + орнитин

1. цитруллин 2. аргинин 3. фумарат А. уреаза Б. аргиназа В. фумараза

6.6. Количественное определение креатинина в моче

Креатинин является одним из конечных продуктов азотистого обмена (5% от общего азота мочи). Он образуется в мышечной ткани из креатинфосфата.

Креатинфосфат ® Креатинин + Фн

В свою очередь креатинфосфат синтезируется из креатина в реакции, катализируемой креатинкиназой (креатинфосфокиназой, КФК) с участием АТФ.

Креатин + АТФ Креатин~Р + АДФ

Эта реакция обратима и образование АТФ в обратной реакции является экстренным механизмом обеспечения энергией для мышечного сокращения.

В норме с мочой выделяется только креатинин. Появление креатина в моче (креатинурия) свидетельствует о заболеваниях печени, почек, сахарном диабете, эндокринных расстройствах (гипертиреоз, аддисонова болезнь, акромегалия и др.), инфекционных заболеваниях. Исключением является появление креатина в моче у подростков и у беременных женщин.

Гиперкреатининурия с одновременной креатинурией имеет место при патологии поперечно-полосатых мышц: миозит, миастения, дистрофия. Гипокреатининурия наблюдается при хроническом нефрите, мышечной атрофии после перенесенных инфекций, в старческом возрасте.

Цель работы

Определить содержание креатинина в суточной моче и сравнить с нормой.

Принцип метода

Метод количественного определения креатинина в моче (по Фолину) основан на цветной реакции с пикриновой кислотой. Интенсивность оранжевой окраски пикрата креатинина, измеряемой на фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром (540 нм), прямо пропорциональна концентрации креатинина, которую определяют по калибровочному графику.

Выполнение работы

Реактивы, этапы Опыт Контроль

NaOH, 10% раствор, мл 1,0 1,0

Пикриновая кислота (насыщ. р-р), мл 1,5 1,5

H₂O дистиллированная, мл — 1,0

Моча, мл 1,0 —

Инкубируют при 20°С 5 минут

Доводят дистиллированной водой до метки в мерной колбе на 50 мл

Перемешивают

Фотометрируют опыт и контроль против воды (l=540 нм, толщина кюветы 1 см). D₅₄₀

Dоп – Dк

Для построения калибровочного графика используют стандартный раствор дихромата калия (K₂Cr₂O₇).

Опытным путем найдено, что оптическая плотность 0,17 М раствора K₂Cr₂O₇ соответствует оптической плотности продукта, образующегося в результате реакции взаимодействия креатинина (концентрация 2 мг/мл) с пикриновой кислотой в щелочной среде. Поэтому калибровочную кривую легко можно построить, используя дешевый и легко доступный дихромат калия.

Из исходного раствора 0,17 М дихромата калия готовят ряд разведений: в 4 мерные пробирки отбирают соответственно 1, 2, 3 и 5 мл исходного раствора и все пробы доводят водой до конечного объема 5 мл. Определяют оптическую плотность полученных растворов при 540 нм в кювете толщиной 1 см против воды. Из полученных значений оптической плотности калибровочных растворов вычитают Dк, определенную в работе ранее, и на основании полученных результатов строят график зависимости оптической плотности от концентрации креатинина. Для этого на оси абсцисс откладывают количество миллилитров дихромата калия, соответствующие концентрации креатинина (0,4; 0,8; 1,2 и 2 мг/мл, соответственно). На оси ординат – величину оптической плотности (D₅₄₀ –Dк). Полученную в работе величину (Dоп – Dк) откладывают на графике и находят концентрацию креатинина в моче (С мг/мл). Затем рассчитывают массу креатинина в суточной моче:

m (креатинина) = г/сутки

Норма: у мужчин: 1 - 2 г/сутки (8,8 - 17,6 ммоль/сутки)

у женщин: 0,6 – 1,5 г/сутки (5,3 – 13,2 ммоль/сутки)

Выводы

Тестовые задания по теме: «Особенности обмена отдельных аминокислот»

1) Ответить на каждый вопрос однозначно: «да» или «нет»

1. Глицин участвует в синтезе пуриновых оснований.

2. В состав КоА входит β-аланин.

3. Азот гуанидиновой группы аргинина служит источником образования оксида азота.

4. Монооксигеназы участвуют в образовании катехоламинов.

5. Триптофан может служить предшественником образования рибонуклеотида никотиновой кислоты (витамина РР).

6. Серотонин образуется из серина.

7. Входит ли глутаминовая кислота в состав глутатиона?

8. Является ли гомогентизиновая кислота промежуточным продуктом превращения фенилаланина?

9. Возможно ли превращение гистидина в глутаминовую кислоту?

10. Является ли креатинфосфат макроэргическим соединением?

11. Может ли цистеин подвергаться процессу декарбоксилирования?

12. Возможны ли превращения глицина в серин и треонин?

2) Выбрать один правильный ответ

Молекула глицина не участвует в синтезе: 1. гема 2. пуриновых оснований 3. пиримидиновых оснований 4. парных желчных кислот 5. креатина Соединение, которое не образуется из тирозина: 1. гомогентизиновая кислота 2. адреналин 3. норадреналин 4. дофамин 5. фенилаланин

3) Установить соответствие Х (цифра) и Y (буква)

Y

Х+ глицин гуанидинацетат + орнитин

1. лизин 2. аргинин 3. метионин А. метилтрансфераза Б. глицинамидинотрансфераза В. аланинаминотрансфераза

Тестовые задания по теме: «Регуляция и патология аминокислотного обмена»

1) Ответить на каждый вопрос однозначно: «да» или «нет»

1. Фенилкетонурия возникает в результате врожденного нарушения синтеза фенилаланин-4-монооксигеназы.

2. Моча с запахом кленового сиропа появляется при нарушении обмена разветвленных аминокислот.

3. Квашиоркор наблюдается у детей при недостатке в пище белков.

4. Алкаптонурия - врожденный дефект обмена триптофана.

5. Фенилкетонурию можно выявить по повышенному содержанию фенилаланина в сыворотке крови.

6. Квашиоркор сопровождается снижением сопротивляемости организма инфекциям.

7. Сопровождается ли повышение концентрации аминокислот в крови ацидемией?

8. Достигает ли положительного эффекта при фенилкетонурии исключение из пищи тирозина?

9. Используются ли ингибиторы моноаминоксидаз при лечении депрессивных состояний?

10. Связана ли болезнь Хартнупа с нарушением всасывания триптофана?

11. Вызывает ли недостаток витамина В₆ нарушения обмена отдельных аминокислот?

12. Может ли недостаток метионина привести к жировому перерождению печени?

2) Выбрать один правильный ответ

Фенилпировиноградная олигофрения развивается в результате врожденного отсутствия фермента класса: 1. оксидоредуктаз 2. трансфераз 3. гидролаз 4. лиаз 5. изомераз Альбинизм связан с нарушением обмена: 1. метионина 2. серина 3. цистеина 4. тирозина 5. триптофана

3) Установить соответствие между патологией и АМК, нарушение обмена или всасывания которой в кишечнике имеет место при данной патологии

1.фенилпровиноградная олигофрения 2. болезнь Хартнупа 3. алкаптонурия А. фенилаланин Б. тирозин В. триптофан

6.7. Коллоквиум по теме: «Обмен простых белков»

Вопросы, для самостоятельной подготовки

1. Понятие о биологической ценности белков. Роль белка в питании. Заменимые и незаменимые аминокислоты.

2. Общие пути превращения аминокислот в тканях.

3. Дезаминирование аминокислот. Механизмы окислительного дезаминирования.

4. Пути превращения безазотистого остатка аминокислот. Гликогенные и кетогенные аминокислоты.

5. Трансаминирование аминокислот. Ферменты и коферменты трансаминирования. Трансдезаминирование и трансреаминирование. Диагностическое значение определения аминотрансфераз в сыворотке крови.

6. Реакции гидроксилирования и декарбоксилирования ароматических аминокислот.

7. Декарбоксилирование аминокислот. Образование биогенных аминов и их биологическая роль. Распад биогенных аминов. Моноаминоксидазы.

8. Пути образования аммиака в организме. Биосинтез мочевины.

9. Образование ядовитых продуктов гниения белков в кишечнике и механизм их обезвреживания в печени.

10. Пути превращения безазотистого остатка аминокислот. Гликогенные и кетогенные аминокислоты.

11. Особенности обмена глицина и серина.

12. Особенности обмена серосодержащих аминокислот.

13. Особенности обмена аргинина.

14. Особенности обмена дикарбоновых аминокислот.

15. Особенности обмена фенилаланина и тирозина. Фенилпировиноградная олигофрения. Алкаптонурия. Экспресс-метод определения повышенного содержания фенилаланина в сыворотке крови.

16. Синтез креатина. Креатинфосфат. Количественное определение креатинина в моче.

17. Связь обмена белков, жиров и углеводов.

Варианты письменной части коллоквиума

1. Механизм активации: I. пепсиногена II. трипсиногена III. химотрипсиногена IV. проэластазы 2. Написать реакции обезвреживания в печени: I. фенолов II. индола III. бензойной кислоты IV. аммиака 3. Рассмотреть механизм реакций и участие коферментов в процессах: I. гидроксилирования II. трансдезаминирования III. трансреаминирования IV. метилирования

4. Наиболее полно указать фармакологические эффекты: I. дофамина II. гистамина III. серотонина IV. норадреналина 5. Разобрать случаи нарушения обмена: I. триптофана II. тирозина III. серосодержащих аминокислот IV. аминокислот с разветвленной цепью 6. В биосинтезе каких соединений участвует: I. метионин? II. аргинин? III. глутамин? IV. глицин?

Варианты заданий на компьютерном тестировании

1. В обезвреживании аммиака участвуют аминокислоты 1 гистидин 2 аспарагиновая кислота 3 аланин 4 глутаминовая кислота 5 триптофан 2. Кофермент глутаматдегидрогеназы в реакции образования a-кетоглутаровой кислоты 1 НАД⁺ 2 ПФ 3 ФАД 4 ФМН 5 КоQ (убихинон) 3. Прием какой аминокислоты может помочь больным со стойким увеличением содержания аммиака в крови? 1 гистидина 2 аспарагина 3 глутамина 4 глутаминовой кислоты 5 лизина 4. Врожденный дефект синтеза фермента гомогентизинат-1,2-диоксигеназы вызывает 1 фенилкетонурию 2 болезнь Паркинсона 3 алкаптонурию 4 альбинизм 5 гомоцистинурию 5. В синтезе креатина участвуют 1 аргинин 2 лейцин 3 метионин 4 серин 5 глицин 6. Суточное выделение креатинина с мочой 1 0,1–0,2 г/сутки 2 1,0–2,0 г/сутки 3 10–20 г/сутки 4 1,0–2,0 мг/сутки 5 10–20 мг/сутки 7. Процесс трансаминирования аминокислот 1 обеспечивает синтез биогенных аминов 2 происходит при участии пиридоксальфосфата 3 обеспечивает образование заменимых аминокислот 4 сопровождается образованием аммиака 5 приводит к увеличению общего количества аминокислот 8. В орнитиновом цикле участвуют 1 цитруллин 2 лизин 3 аланин 4 аргинин 5 аспарагин 9. К смешанным (гликогенным и кетогенным) аминокислотам относятся 1 триптофан 2 тирозин 3 фенилаланин 4 серин 5 лейцин 10. ТГФК участвует в синтезе 1 серина из глицина 2 цистеина из метионина 3 тирозина из фенилаланина 4 глутаминовой кислоты из гистидина 5 глутамина из глутамата 11. Процессу трансаминирования не подвергаются 1 глутамин и аспарагин 2 лизин и треонин 3 изолейцин и аспартат 4 фенилаланин и тирозин 5 аланин и валин 12. Аммиак в клетках мозга обезвреживается путем 1 синтеза мочевины 2 образования солей аммония 3 превращения глутамата в глутамин 4 образования аланина 5 синтеза креатина 13. Кофермент большинства декарбоксилаз аминокислот 1 ФАД 2 ФМН 3 ПФ 4 ТПФ 5 биотин 14. Гистидаза относится к классу 1 оксидоредуктаз 2 трансфераз 3 гидролаз 4 лиаз 5 изомераз 15. Скатол и индол обезвреживаются в печени с помощью 1 глицина 2 глутамата 3 a-кетоглутарата 4 уридиндифосфоглюкуроновой кислоты 5 пролина 16. Пиридоксальфосфат (ПФ) – кофермент 1 аланинаминотрансферазы 2 амилазы 3 аспартатаминотрансферазы 4 моноаминоксидазы 5 глутаматдегидрогеназы 17. Метаболит ЦТК, участвующий в реакциях трансаминирования 1 цитрат 2 a-кетоглутарат 3 сукцинат 4 фумарат 5 малат 18. g-аминомасляная кислота образуется из 1 гистидина 2 аспарагиновой кислоты 3 глутаминовой кислоты 4 глутамина 5 аспарагина 19. Суточное выведение мочевины с мочой в норме 1 25–35 мг 2 0,25–0,35 г 3 2,5–3,5 г 4 25–35 г 5 250–350 г 20. Глицин может образоваться из 1 метионина 2 лизина 3 валина 4 тирозина 5 серина 21. Альбинизм связан с нарушением обмена 1 метионина 2 серина 3 цистеина 4 тирозина 5 триптофана 22. Оксид азота (NO) образуется из азота 1 аргинина 2 цистеина 3 валина 4 гистидина 5 серина 23 Коферментом оксидаз L-аминокислот может быть 1 ФМН 2 ПФ 3 НАД⁺ 4 НАДФ⁺ 5 КоА 24. Активность аспартатаминотрансферазы в сыворотке крови резко повышается при 1 заболеваниях почек 2 панкреатитах 3 простатитах 4 нефритах 5 инфаркте миокарда 25. Соляная кислота в желудке 1 денатурирует белки 2 оказывает бактерицидное действие 3 активирует пепсиноген 4 создает оптимум рН для пепсина 5 ингибирует пепсиноген 26. Кофермент моноаминоксидазы (МАО) 1 НАД⁺ 2 ФАД 3 НАДН(Н⁺) 4 ТПФ 5 ПФ 27. Квашиоркор наблюдается у детей при недостатке в пище 1 углеводов 2 липидов 3 белков 4 витаминов 5 минеральных веществ 28. Источником образования таурина является 1 метионин 2 цистеин 3 глицин 4 серин 5 треонин

29. Строго кетогенной аминокислотой считается 1 лейцин 2 аланин 3 серин 4 глутамин 5 лизин 30. При гнилостном распаде фенилаланина в кишечнике образуются 1 фенол 2 скатол 3 индол 4 крезол 5 лейцин 31. Алкаптонурия – врожденный дефект обмена 1 триптофана 2 гистидина 3 метионина 4 тирозина 5 глицина 32. Биосинтез мочевины происходит в 1 мозге 2 мочевом пузыре 3 поджелудочной железе 4 надпочечниках 5 печени 33. Суточная потребность белка у человека составляет примерно 1 100 г 2 100 мг 3 10 г 4 1000 мг 5 1000 г 34. Коферментами дезаминирования аминокислот могут быть 1 НАД⁺ 2 ФАД 3 ФМН 4 ТПФ 5 КоА 35. В процессе восстановительного аминирования a-кетоглутаровой кислоты участвует 1 НАДФ⁺ 2 НАДФН(Н⁺) 3 ФАДН₂ 4 ФМНН₂ 5 НАД⁺ 36. Серотонин – продукт декарбоксилирования 1 гистидина 2 тирозина 3 пролина 4 фенилаланина 5 5-окситриптофана 37. Строго кетогенная аминокислота 1 аланин 2 валин 3 триптофан 4 лейцин 5 метионин 38. Аргиназа участвует в синтезе 1 оксида азота 2 креатина 3 мочевины 4 серина 5 белка 39. Монооксигеназы участвуют в образовании 1 тирозина 2 диоксифенилаланина 3 норадреналина 4 аспарагина 5 глутамина 40. Внутримолекулярному дезаминированию в организме человека подвергается 1 глицин 2 глутамин 3 гистидин 4 тирозин 5 триптофан 41. Соединения, образующиеся из тирозина 1 g-аминомасляная кислота 2 адреналин 3 норадреналин 4 дофамин 5 фенилаланин 42. Основной кофермент обмена аминокислот 1 КоА 2 ТПФ 3 НАД⁺ 4 биоцитин 5 ПФ 43. Фенилпировиноградная олигофрения развивается в результате врожденного отсутствия фермента класса 1 лиаз 2 лигаз 3 гидролаз 4 изомераз 5 оксидоредуктаз 44. Из аминокислоты тирозина образуются 1 серотонин 2 диоксифенилаланин 3 дофамин 4 норадреналин 5 индол 45. Активация пепсиногена в пепсин осуществляется 1 трипсином 2 химотрипсином 3 пепсином 4 энтерокиназой 5 амилазой 46. Скатол и индол образуются при гнилостном распад в кишечнике 1 тирозина 2 фенилаланина 3 триптофана 4 гистидина 5 пролина 47. Врожденный недостаток фермента фенилаланин-4-монооксигеназы (фенилаланингидроксилазы) вызывает 1 фенилпировиноградную олигофрению 2 болезнь Паркинсона 3 алкаптонурию 4 альбинизм 5 гомоцистинурию 48. Фермент секрета поджелудочной железы, не проявляющий протеолитической активности 1 трипсин 2 химотрипсин 3 амилаза 4 карбоксипептидаза 5 аминопептидаза 49. Диоксифенилэтиламин (дофамин) является 1 биогенным амином 2 предшественником синтеза норадреналина 3 сосудорасширяющим агентом 4 производным триптофана 5 предшественником g-аминомасляной кислоты (ГАМК) 50. Биологическая ценность белка определяется 1 аминокислотным составом 2 наличием заряда белка 3 возможностью расщепления в желудочно-кишечном тракте 4 содержанием в белке незаменимых аминокислот 5 молекулярной массой белка 51. Ферменты, участвующие в цикле мочевинообразования Кребса 1 аргиназа 2 креатинкиназа 3 карбамоилфосфатсинтетаза 4 уреаза 5 фумараза 52. В моче пациента обнаружено значительное количество гомогентизиновой кислоты. Указать возможную патологию 1 альбинизм 2 болезнь Паркинсона 3 цистинурия 4 алкаптонурия 5 фенилкетонурия 53. Наиболее интенсивному дезаминированию в печени подвергается 1 сер 2 гис 3 цис 4 асп 5 глу 54. Общий метаболит процессов синтеза мочевины и ЦТК 1 сукцинил-КоА 2 сукцинат 3 аспартат 4 фумарат 5 малат 55. Гистидаза (гистидинаммиаклиаза) катализирует реакцию 1 декарбоксилирования 2 окислительного дезаминирования 3 карбоксилирования 4 внутримолекулярного дезаминирования 5 метилирования 56. Метионин участвует в синтезе 1 адреналина 2 цистеина 3 мочевины 4 фосфатидилхолина 5 норадреналина

Правильные ответы

1.2, 4 2.1 3.4 4.3 5.1, 3, 5 6.2 7.2, 3 8.1, 4 9.1, 2, 3 10.1 11.2 12.3 13.3 14.4 15.4 16.1, 3 17.2 18.3 19.4

20.5 21.4 22.1 23.1 24.5 25.1, 2, 3, 4 26.2 27.3 28.2 29.1 30.1, 4 31.4 32.5 33.1 34.1, 2, 3 35.2 36.5 37.4 38.3

39.1, 2, 3 40.3 41.2, 3, 4 42.5 43.5 44.2, 3, 4 45.3 46.3 47.1 48.3 49.1, 2 50.1, 3, 4 51.1, 3 52.4 53.5 54.4 55.4 56.1, 2, 4

Раздел 7: Обмен хромопротеинов и нуклеопротеинов. Биохимия крови и мочи. Биосинтез нуклеиновых кислот и белков.

Введение

В обмене сложных (конъюгированных) белков особый интерес представляет синтез и распад небелкового компонента, так как превращения белковой части молекулы происходят аналогично простым белкам (см. раздел 6). Углеводные, липидные и неорганические компоненты подвергаются обычным превращениям в процессе обмена веществ.

Часть сложных белков организма содержит в своем составе гем (гемоглобин, миоглобин, цитохромы, гемсодержащие ферменты). При распаде гема образуется билирубин, который является малорастворимым, токсичным соединением. Током крови билирубин доставляется в печень и там конъюгирует с глюкуроновой кислотой, таким образом, повышается его растворимость и снижается токсичность. Под влиянием различных факторов может нарушаться образование и выведение билирубина и продуктов его метаболизма из организма. Повышение содержания билирубина в крови ведет к отложению его в тканях, вызывая их окрашивание в желтый цвет (желтуха).

Небелковая часть нуклеопротеинов распадается на соответствующие нуклеотиды под действием специфических нуклеаз. Конечным продуктом распада пуриновых нуклеотидов у человека является мочевая кислота, которая удаляется из организма главным образом с мочой. Повышение концентрации мочевой кислоты в сыворотке крови за счет нарушения обмена или поступления в организм значительных количеств пищи, содержащей нуклеопротеины, на фоне снижения рН ведет к отложению натриевых солей мочевой кислоты (уратов) в мягких тканях и суставах, как следствие развивается подагра.

В этом разделе студентам предлагается провести определение концентрации общего билирубина в сыворотке крови, а также содержания мочевой кислоты в моче.

Доступность крови и мочи для исследований делают биохимический анализ этих объектов чрезвычайно значимыми для врачей-клиницистов, как в процессе постановки диагноза, так и для дальнейшей оценки состояния пациентов и, что не менее важно, оценки эффективности проводимой терапии.

Кровью ко всем тканям организма доставляются кислород и различные питательные вещества, поступающие извне. Конечные продукты обмена веществ выводятся с мочой. Изменение химических процессов в организме приводит к изменению состава крови и мочи, в одних случаях к дисбалансу химических веществ, присутствующих в норме, в других – к появлению в исследуемых объектах соединений, в норме отсутствующих.

Для оценки некоторых показателей крови и мочи можно использовать экспресс-тесты (тестовые полоски), которые позволяют определить рН и полуколичественно оценить содержание глюкозы, ацетоновых (кетоновых) тел, белка, билирубина и некоторых других диагностически важных соединений.

Особое значение имеет изучение ферментного состава крови и мочи. Понижение или повышение активности так называемых диагностически значимых ферментов, а также появление ферментов, отсутствующих в норме, служат объективным диагностическим критерием патологических изменений.

Именно поэтому в разделе представлены практические работы, в которых предлагается оценить активность ферментов: амилазы, лактатдегидрогеназы и холинэстеразы, - с тем, чтобы составить представление о методах энзимодиагностики. В каждой работе приведены нормальные значения соответствующих величин, а также указаны причины, по которым возможны отклонения показателей от нормы.

7.1. Определение общего билирубина в сыворотке крови

Билирубин – промежуточный продукт распада гема и основной желчный пигмент человека. Образование большей части билирубина (около 85%) происходит при распаде гемоглобина эритроцитов, а остальные 15 % билирубина образуются при распаде гема миоглоглобина, цитохромов, каталазы, пероксидазы и других гемопротеинов.

Различают две формы билирубина:

1. свободный (неконъюгированный, непрямой) билирубин токсичен (особенно для мозга), плохо растворим в воде и связывается сывороточным альбумином (транспортная форма в крови).

2. связанный (конъюгированный, прямой) билирубин образуется в печени конъюгацией с УДФ-глюкуроновой кислотой. В результате образуется нетоксичный, хорошо растворимый в воде диглюкуронид билирубина выводимый из организма.

Суммарно, обе эти формы определяют как общий билирубин.

Определение в клинике содержания билирубина в крови (непрямого, прямого, общего), а также уробилиногена в моче используют для дифференциальной диагностики желтух различной этиологии.

Цель работы

Определить концентрацию общего билирубина в сыворотке крови и сравнить полученный результат с нормальными величинами.

Принцип метода

Общий билирубин определяют реакцией с диазотированной сульфаниловой кислотой после диссоциации свободного билирубина в присутствии кофеинового реагента. В результате реакции образуется азосоединение розового цвета, которое после добавления щелочного буфера меняет окраску на зеленую. Контроль не содержит нитрита натрия, необходимого для диазотирования сульфаниловой кислоты. Оптическая плотность растворов, измеренная при 578 нм, пропорциональна содержанию билирубина в пробе.

Выполнение работы (см. приложение)

Реактивы	Опыт	Контроль
Сульфаниловая кислота, мл	0,2	0,2
Раствор нитрита натрия, мл	0,05	-
Кофеиновый реагент, мл	1,0	1,0
Сыворотка, мл	0,2	0,2
Тщательно перемешивают и инкубируют 20 минут при комнатной температуре
Щелочной буфер, мл	1,0	1,0
Тщательно перемешивают и инкубируют 10 минут при комнатной температуре
Фотометрируют против Н₂О (l = 578 нм, толщина кюветы 0,5 см) D₅₇₈
Dоп - Dк

Концентрацию общего билирубина рассчитывают по формуле:

С_{(билирубина)} = 183 ^. (Dоп – Dк) мкмоль/л или

С_{(билирубина)} = 10,7 ^. (Dоп – Dк) мг/дл

(183 и 10,7 – пересчетные коэффициенты для получения концентрации билирубина в соответствующих единицах – см. Rendox, Manual procedures, Edition III, Bilirubin, Colorimetric Method)

Норма: взрослые: 8,5-20,5 мкмоль/л (0,5 – 1,2 мг/дл)

дети: 17-200 мкмоль/л (1,0 – 11,7 мг/дл)

Выводы

Тестовые задания по теме: «Синтез и распад гема»

1) Ответить на каждый вопрос однозначно: «да» или «нет»

1. Амидный азот глутамина может использоваться для синтеза гема.

2. Синтез гема происходит в цитоплазме клеток.

3. Ацетил-КоА необходим для синтеза гема.

4. Прямой билирубин - это моно- или диглюкуронид билирубина.

5. Непрямой билирубин входит в состав желчных камней.

6. Железо для синтеза гема запасается в ферритине.

7. Регулируется ли биосинтез гема по типу обратной связи?

8. Является ли δ-аминолевулинатсинтаза аллостерическим ферментом?

9. Образуется ли стеркобилиноген в печени?

10. Окрашен ли билирубин?

11. Нужен ли глицин для биосинтеза гема?

12. Выводится ли биливердин с мочой?

2) Выбрать один правильный ответ

Продукты распада гема: 1. желчные кислоты 2. желчные пигменты 3. протопорфирины 4. уропорфирины 5. все вышеперечисленные соединения

Коферментом d-аминолевулинатсинтазы является: 1. ФАД 2. НАД⁺ 3. ПФ 4. ТПФ 5. тетрагидробиоптерин

3) Найти соответствие процесса и участвующего в нем метаболита

1. синтез гема 2. распад гема 3. синтез пиримидиновых нуклеотидов 4. распад пиримидиновых нуклеотидов 5. распад пуриновых нуклеотидов

А. Ксантин Б. Уропорфиноген В. Биливердин Г. Оротовая кислота Д. β-аланин