Доказательство проявления активности аланин-аминотрансферазы (АлАТ) методом бумажной хроматографии

Аланинаминотрансфераза (АлАТ), как и другие аминотрансферазы, участвует во взаимном превращении a-аминокислот и a-кетокислот в цитозоле клетки.

Аланин + a-Кетоглутарат Пируват + Глутамат

Поэтому активность АлАТ можно определить качественно по появлению в реакционной смеси новой аминокислоты, образовавшейся в результате переноса аминогруппы от аланина или глутамата на a-кетоглутарат или пируват соответственно (в зависимости от того в каком направлении проводится реакция).

Цель работы

Методом бумажной хроматографии показать наличие активности АлАТ и определить, какая аминокислота (аланин или глутамат) присутствовала в исходной субстратной смеси, то есть в каком направлении проводилась ферментативная реакция.

Принцип метода.

Поскольку в результате ферментативной реакции образуется новая аминокислота, осуществляют идентификацию исходной и образующейся под действием АлАТ аминокислот методом радиальной бумажной хроматографии (см. работу 1.4.Б «Хроматографическое разделение аминокислот»). Идентификацию проводят после окраски нингидрином по сравнению величин R_f исследуемых АМК со стандартными, которые разделяют одновременно в тех же условиях. Для решения задачи необходимо провести три независимых хроматографических разделения: 1) субстратной смеси (одна аминокислота); 2) субстратной смеси + АлАТ (образуется вторая аминокислота); 3) стандартного раствора аланина и глутамата для идентификации.

Выполнение работы

Берут три диска хроматографической бумаги диаметром 12 см. Простым карандашом сверху обозначают фамилию студента и номер диска. В центре каждого диска обводят круг диаметром 0,3-0,4 см. Микропипеткой в центр дисков наносят реактивы, как указано в таблице.

Диски	I субстрат	II cубстрат + фермент	III стандарт
Реактивы
Субстратная смесь (аминокислота + кетокислота)	2 мкл	2 мкл	—
Стандартная смесь (глутамат + аланин)	—	—	2 мкл
Раствор АлАТ	—	2 мкл	—
Число окрашенных зон и характер окраски
Rf для каждой зоны аминокислоты

Через 10 минут после нанесения последнего реагента (время инкубации) все три диска подсушивают на воздухе. На каждом диске от края к центру делают ножницами два параллельных разреза (ширина разреза равна диаметру кружочка в центре диска). Вырезанную полоску отгибают перпендикулярно диску так, чтобы линия сгиба проходила через середину зоны нанесения растворов. «Ножку» укорачивают до 2-3 см, и диск помещают между нижней и верхней половинками чашки Петри, содержащей смесь бутанол + уксусная кислота + Н₂О в соотношении 5:1:4. Проводят хроматографическое разделение под тягой приблизительно в течение 1 часа. Диски извлекают из хроматографической камеры и обводят фронт растворителя простым карандашом. Высушивают в сушильном шкафу при 100°С, смачивают раствором нингидрина и снова высушивают[§§].

Рассчитывают величину R_f для каждой окрашенной зоны и проводят идентификацию аминокислот. Делают вывод о том, какая аминокислота находилась в субстратной смеси. Затем вырезают сегменты из каждого диска и складывают их вместе рядом, совмещая центральные зоны нанесения вещества.

Пояснение к рисунку: Ала – аланин Глу – глутаминовая кислота

Выводы