В основе молекулярного клонирования лежит встраивание нужного фрагмента ДНК в другую молекулу ДНК, которая способна реплицироваться (информация, закодированная в последовательности оснований родительской ДНК, передается с точностью дочерней ДНК) в соответствующей клетке-хозяине. Молекулы ДНК, используемые для переноса встроенного материала в бактериальные клетки, называют векторами. Такое встраивание осуществляется in vitro, а затем полученные рекомбинантные ДНК вводят в клетки.
Векторная молекула непременно должна содержать точку начала репликации – ori. Кроме того, для репликации необходимы специфические ферменты и вспомогательные белковые факторы. Их источником служит клетка-хозяин или они кодируются самим вектором. Вектором может быть любой небольшой внехромосомный элемент – плазмида, ДНК фага или ДНК-вируса, космиды, фазмиды.
Наиболее широко применяются такие комбинации, когда в роли хозяина выступает штамм E. coli К12, а в роли вектора – плазмиды и разные фаги E. coli. Предпочтительное использование этого штамма обусловлено тем, что именно в клетках E. coli К12 беспрепятственно реплицируются многие бактериофаги и плазмиды, которые могут быть использованы в качестве потенциально полезных векторов, и этот штамм наиболее изучен.
Плазмидные векторы
Классификацируют плазмиды в зав-ти от наличия в них модульных сегментов ДНК. Каждый модульный сегмент может содержать один или несколько генов, или цис -действующих элементов таких, как, например, локус ori. Каждая плазмида должна иметь по крайней мере один репликационный модуль, который позволит ей активно размножаться в реципиентной клетке. Наличие других модулей, отличных от репликационных, не является обязательным для каждой плазмиды.
Половые факторы, называемые коньюгативными плазмидами, (например F-плазмида) имеют модули конъюгации, содержащие гены и регуляторные области, необходимые для переноса плазмиды из одной клетки в другую. Некоторые из неконьюгативных плазмид (без модуля коньюгации) могут быть перенесены из одной клетки в другую, если они совмещены в донорной клетке с половым фактором.
Модули другого типа содержат гены, белковые продукты которых обеспечивают инактивацию антибиотиков. Плазмиды, несущие такие модули, часто называют R-плазмидами (от англ. resistance – устойчивость). Нередко одна плазмида придает устойчивость к нескольким антибиотикам, при этом несколько или даже все гены резистентности разного типа могут быть сгруппированы в одном модуле.
Имеется еще один тип модулей, встречающийся в составе как коньюгативных, так и неконьюгативных плазмид – это col- модули. Col -модули представляют собой гены, кодирующие один из нескольких белков – колицинов – антибактериальных агентов, продуцируемых бактериями. Колицины отличаются по структуре и механизму действия. Очень часто col- плазмиды, кодирующие определенный колицин, содержат гены, обеспечивающие иммунность к этому колицину, защищая таким образом клетку-продуцент от повреждений, вызываемых ее собственным средством защиты.
Плазмиды, исходно обнаруженные в природе, были впоследствие модифицированы, укорочены, реконструированы и подвергнуты рекомбинации как in vivo, так и в условиях in vitro. Целью всех этих манипуляций было получение универсальных плазмид или, напротив, плазмид, предназначенных для решения каких-то конкретных экспериментальных задач. Лучшие из них содержали генетические маркеры, позволяющие упростить отбор тех бактериальных клеток, которые включали рекомбинантные молекулы.
Помимо того, что генетические маркеры позволяют выделять клоны бактериальных клеток, содержащие рекомбинантную плазмиду, они выполняют еще одну важную функцию. Если плазмида в определенных условиях не выполняет свою функцию, то клетки обычно растут и размножаются более эффективно в отсутствие «лишней» внехромосомной ДНК. Поэтому те клетки, которые утрачивают плазмиду быстро перерастают другие, при этом рекомбинанты элиминируются. В противном случае, если клетки находятся в таких условиях, когда их жизнеспособность зависит от плазмиды, элиминируются клетки утратившие вектор.
Свойства идеального плазмидного вектора. Идеальный плазмидный вектор для молекулярного клонирования должен удовлетворять следующим требованиям:
1. вектор должен содержать минимальное количество ДНК;
2. репликация вектора должна регулироваться по типу ослабленного -(что приводит к появлению в клетке многих копий плазмид), а не строгого контроля, чтобы обеспечить высокий выход ДНК;
3. вектор должен содержать не менее двух селективных маркеров и иметь один сайт узнавания для рестриктирующей эндонуклеазы. Последнее свойство позволяет разрезать кольцевую ДНК в уникальном сайте, по которому впоследствии осуществляют лигирование со вставкой;
4. для максимально простого отбора трансформантов, уникальный сайт рестрикции должен располагаться в пределах одного из двух селективных маркеров;
5. вставка не должна прерывать последовательность, необходимую для сохранения самой плазмиды.
Из всех векторов при работе с E. coli наибольшей популярностью пользуется плазмида pBR322. Данная плазмида обладает многими свойствами идеального вектора для клонирования. Поскольку pBR322 реплицируется по типу Col Е1 (Col Е1-это плазмида, которая способна накапливать несколько тысяч копий плазмидного генома, даже когда клетка не растет и не делится), удается получить плазмидную ДНК с высоким выходом. Плазмида содержит два селективных гена-маркера, придающих устойчивость к тетрациклину и ампициллину. Каждый из 12 сайтов узнавания рестриктазами встречается в молекуле только один раз, что позволяет получать линейные молекулы с разнообразными «липкими» концами. Известна полная нуклеотидная последовательность этого вектора длиной 4362 пары нуклеотидов.
Клетки E. coli, содержащие плазмиду pBR322, выращивают в среде с ампициллином или тетрациклином либо в присутствии обоих антибиотиков, при этом клетки, утратившие плазмиду, не растут в присутствии любого из двух антибиотиков. Если какой-либо фрагмент ДНК внедрен в область pBR322, ответственную за устойчивость к тетрациклину (например, в сайт рестрикции Bam HI или Sal I), то такие трансформанты сохраняют способность расти на среде с ампициллином, но не растут на среде с тетрациклином. Если же вставка происходит по ампициллиновому гену (по сайтам рестрикции Pvu I или Pst I), то наблюдается обратная ситуация. При любой локализации вставки легко осуществить отбор только тех колоний бактериальных клеток, которые несут рекомбинантную плазмидную ДНК.
Фаговые векторы
Фрагмент чужеродной ДНК, встроенный в фаговую векторную ДНК in vitro, можно ввести в клетки подходящего хозяина как в виде изолированной ДНК (трансфекция), так и в форме реконструированных вирусных частиц (инфекция). В любом случае в клетке, инфицированной молекулой рекомбинантного вирусного вектора, образуется вирусное потомство, которое лизирует клетку и будет инфицировать соседние клетки, что в конечном итоге и приводит к формированию бляшек или как их еще называют негативных колоний. Само по себе образование бляшек уже свидетельствует об успехе инфекции (или трансфекции). В целом же фаговые векторы более эффективны, чем плазмидные, особенно при клонировании крупных вставок, и скрининг большого числа негативных колоний на содержание вставки провести проще, чем скрининг большого количества бактериальных колоний. Самыми распространенными векторами для E. coli являются два бактериофага – фаги l и М13.
Молекула ДНК фага l, состоящая из 48502 пар нуклеотидов, включает область начала репликации, а также гены, кодирующие структурные вирусные белки и ферменты необходимые для репликации ДНК, лизиса инфицированных клеток и установления лизогении. Приблизительно 30% генома представлено областью, необязательной для литической инфекции. Как правило многие или даже все гены, нужные для лизогении, удаляются, поэтому инфицирование E. coli рекомбинантным вектором всегда сопровождается лизисом клетки-хозяина.
Фаг М13 входит в группу нитевидных бактериофагов E.coli. Геном фага представлен одноцепочечной кольцевой ДНК, котор. упакована в капсид. Фаг M13 способен инфицировать клетки T.coli только если они обладают F-пилями.
Плазмидно-фаговые векторы
К таким гибридным векторам относятся космиды и фазмиды.
Космиды – один из типов гибридных векторов, которые характеризуются плазмидным типом репликации и обладают способностью упаковываться в условиях in vitro в головки фага l. Типичная космида содержит область начала репликации, включает уникальные сайты рестрикции и селективные маркеры, принадлежащие плазмидной ДНК, которая объединена с фрагментом ДНК фага l, содержащим фаговые «липкие» концы (cos -cайты). Реципиентные клетки-хозяева приобретают упакованные в вирионы космиды в результате инфицирования «фальшивыми» фаговыми частицами. Попав в клетку, рекомбинантная ДНК амплифицируется и сохраняется в ней в виде плазмиды.
Космиды по существу являются плазмидными векторами, имеющими лишь cos -cайт фага l, необходимый для осуществления эффективной упаковки рекомбинантной ДНК in vitro.
Истинными гибридами плазмиды и фага являются фазмиды – линейные дуплексные молекулы ДНК, на концах которых расположены сегменты ДНК фага l, содержащие все гены, требующиеся для литической инфекции, а средняя часть представлена линеаризованной плазмидой. Функции репликации как фага, так и плазмиды в фазмидах полностью сохранены. Обычно такие векторы содержат несколько повторов плазмидной части, обеспечивающих необходимую для упаковки ДНК протяженность генома. Один или несколько плазмидных повторов при конструировании рекомбинантных ДНК заменяют соответствующей вставкой.
Фазмидные ДНК перед инфицированием упаковывают in vitro в фаговые головки. Попадая в клетку E. coli, фазмида реплицируется как фаговая ДНК, в результате чего на газоне чувствительных клеток образуются бляшки. Однако если вектор содержит ген, кодирующий репрессор фага l, то фазмида реплицируется как плазмида, а не как фаг.
