Двухцепочечные кольцевые молекулы ДНК обычно имеют в структуре соответствующие изгибы и петли, которые получили название супервитков и которые хорошо различимы при использовании электронной микроскопии.
Как образуются такие кольцевые молекулы? Кольцевая структура ДНК может сформироваться за счет сближения и ковалентного соединения, соответствующих 3'- и 5 '-концевых групп линейной молекулы с образованием фосфодиэфирных связей. Если при этом с данной молекулой ДНК не производить никаких манипуляций, результатом соединения концов будет образование релаксированной кольцевой ДНК, т.е. такой кольцевой двухцепочечной структуры, которая находится в термодинамически выгодном состоянии и характеризуется параметрами двойной спирали в классической В-форме, а это означает, что такая спираль включает 10 пар нуклеотидов на один полный оборот.
Однако, если перед соединением концов линейной ДНК один из «хвостов» молекулы зафиксировать, а другой повернуть на один или несколько полных оборотов в направлении раскручивания двойной спирали, то в результате получится напряженная структура. Она характеризуется недостатком оборотов. И называется отрицательно суперспирализованной ДНК. Возникшие отрицательные супервитки закручивают ДНК против часовой стрелки, т.е. в направлении, противоположном ходу обычной правосторонней двойной спирали. Такую спираль называют недокрученной. Это явление не происходит спонтанно, а инициируется специфическими ферментами геликазой и топоизомеразой.
Отрицательная спирализация может снижать напряжение, возникающее вследствие дефицита витков, с одной стороны путем разрушения водородных связей между комплементарными парами оснований и раскрытием двойной спирали на небольшом участке макромолекулы. В результате разрушения водородных связей получаемая структура может приобрести вид регулярной релаксированной двойной спирали, содержащей небольшую одноцепочечную петлю называемую «пузырьком». Отсюда следует, что излишек энергии, которым обладают отрицательно суперспирализованные молекулы, может быть использован для разделения цепей ДНК. С другой стороны, водородные связи между парами оснований не обязательно должны разрываться. В этом случае, чтобы также смягчить напряжение, введенное в молекулу за счет раскручивания, кольцевая ДНК будет сворачиваться в направлении, противоположном тому, в котором она была повернута до циклизации (образовывать третичную структуру). А также кольцевая отрицательно суперспирализованная ДНК может существовать в виде перекрещенной структуры (в форме восьмерки).
Все существующие в природе молекулы ДНК существуют в виде отрицательных суперспиралей, характеризующихся приблизительно одинаковой плотностью витков для всех типов ДНК независимо от источника.
Положительная суперспираль образуется, если один из концов линейной молекулы ДНК поворачивать в направлении скручивания двойной спирали. В результате получается кольцевая ДНК, содержащая положительные супервитки. Такую ДНК называют перекрученной.
Положительно суперспирализованная ДНК не может снизить напряжение в структуре (посредством разрушения водородных связей или за счет образования скрученных структур, как в случае с отрицательной суперспирализованной ДНК). Только за счет образования соответствующей третичной структуры.
К образованию отрицательно суперспирализованной структуры in vivo способен любой фрагмент двухцепочечной ДНК, у которой один из концов иммобилизован. Напр., линейные ДНК эукариотических клеток могут приобретать суперспирализованное состояние вследствие их взаимодействия с ядерными белками, что создает условия для формирования закрытых топологических доменов.
Явление отриц. суперспирализации ДНК имеет важнейший биологич. смысл, заключ.-ся в обеспечении компактной упаковки генетического материала и в облегчении функционирования процессов репликации и транскрипции ДНК, связанных с необходимостью незатрудненного разделения цепей в двухцепочечных молекулах ДНК.
Явление РНК-интерференции
Одним из способов получения новых сортов декоративных растений, например, петуний, цветы которых обладали бы более яркими бордовыми лепестками, является введение в клетки растения гена, отвечающего за синтез красного пигмента. К удивлению селекционеров, многие цветы после введения дополнительной копии гена, вместо того, чтобы усилить окраску, вовсе теряли пигмент и оказывались белыми. В других экспериментах у кольчатого червя Caenorhabditis elegans (C. elegans) молек. биологи, изучавшие вопросы генетической регуляции, пытались усилить работу определенных генов путем введения в клетки червя дополнительных копий этих генов. И снова, вместо усиления экспрессии данных генов, наблюдался противоположный эффект: его полное «замолкание».
Позже удалось установить, что во всех подобных случаях в клетках подопытных организмов появлялись большие количества особых «малых» РНК. Оказалось, что данные РНК являются копией отдельных участков тех самых генов, которые вводились в клетку, и активность которых вопреки ожиданиям подавлялась. С другой стороны – вместо того, чтобы, как в случае информационных РНК, служить матрицей для синтеза белков и способствовать, тем самым, усилению выраженности гена (например, усиливая цвет петуний), эти РНК каким-то образом препятствовали экспрессии генов. Затем этот феномен был доказан экспериментально
Так была открыта способность малыхРНК подавлять экспрессию генов у животных.
В нормально работающей клетке каждый ген выполняет собственную, строго определенную функцию, например, направляет синтез белка с помощью предварительного образования иРНК или регулирует другие клеточные процессы путем взаимодействия с регуляторными белками. При этом имеет место обычная экспрессия гена в клетке. Эффект «гашения» экспрессии определенных генов малыми РНК получил название РНК-интерференции, а молекулы, вызывающие его, назвали малыми интерферирующими РНК – siRNA.. С открытием молекул siRNA и явления РНК-интерференции, в целом, стало ясно, что этот феномен может иметь огромное практическое значение.
К классу малых РНК вообще относят молекулы, содержащие от 20 до 300 рибонуклеотидов. За эффект РНК-интерференции отвечают самые короткие из них – siRNA, состоящие всего из 21-28 (у млекопитающих из 21-23) нуклеотидов. Структурной особенностью этих молекул является то, что они, в отличие от большинства других клеточных РНК, состоящих всего из одной цепи нуклеотидов, являются двухцепочечными. Нуклеотиды двух цепей siRNA спариваются друг с другом по тем же законам комплементарности, которые формируют двуцепочечные молекулы ДНК в хромосомах. Кроме того, по двум концам каждой siRNA всегда присутствуют одноцепочечные уступы из двух неспаренных нуклеотидов.
Если молекула siRNA по тем или иным причинам появляется в клетке, она сразу же взаимодействует со специфической клеточной системой белков (геликаза и нуклеаза), для которых появление siRNA является сигналом к такому взаимодействию. Геликаза и нуклеаза формируют комплекс RISC ( R NA- i nduced s ilencing c omplex; от англ. silence – молчать, замолкать; silencing – замолкание) (процесс «выключения» гена). Геликаза, в силу своей специфичности, раскручивает цепи siRNA, в результате чего они расходятся. Одна из этих цепей, с которой связана нуклеаза, теперь получает возможность связаться с комплементарным ей участком одноцепочечной мРНК, позволяя нуклеазе разрезать ее. Разрезанные же участки мРНК подвергаются действию других клеточных РНКаз, которые обеспечивают их дальнейшую деградацию.
Итак, основная «специальность» siRNA в клетке – это блокирование тех генов, которые соответствуют одной из цепочек в составе siRNA. Но зачем механизм РНК-интерференции существует в клетках?
1) с помощью siRNA клетка может защищать себя от проникновения вирусов.
If вирус представлен РНК: сам процесс разрезания чужеродной вирусной мРНК в этом случае происходит так же путем активации комплекса ферментов RISC. Однако для большей эффективности растения и насекомые изобрели своеобразный путь усиления защитного действия siRNA. Присоединяясь к цепи мРНК, участок siRNA может с помощью специфического комплекса ферментов, называемого DICER, сначала достроить вторую цепочку мРНК, а затем разрезать ее в разных местах, создавая, таким образом, разнообразные «вторичные» siRNA. Они, в свою очередь, формируют комплексы RISC и обеспечивают полную деградацию чужой т.е. вирусной мРНК. Такие «вторичные» молекулы смогут специфично связываться не только с тем участком вирусной мРНК, к которому была направлена «первичная» молекула, но также и с другими участками, что резко усиливает эффективность клеточной защиты.
Если же вирусный геном представлен ДНК, система siRNA будет препятствовать образованию вирусных белков путем распознавания и разрезания необходимой для этого вирусной мРНК, образующейся в ходе транскрипции.
У млекопитающих, в отличие от насекомых и растений, работает другая система защиты (клетка начинает синтез интерферона).
Каждая siRNA распознает и уничтожает только свою, специфическую мРНК. Замена всего лишь одного нуклеотида в последовательности siRNA ведет к резкому снижению эффекта интерференции. Ни один из блокаторов генов, известных до сих пор, не обладает такой исключительной специфичностью по отношению к своему гену-мишени.
2)открытие siRNA интересно тем, что дает новую надежду в борьбе с вирусами, в том числе с ВИЧ, а также с теми из них, кого подозревают в соучастии при развитии рака. Высокая специфичность и эффективность siRNA вместе с их низкой токсичностью оказываются как нельзя кстати.
Для того, чтобы использовать механизм siRNA-интерференции в клетках млекопитающих, в клетки нужно ввести уже готовые двухцепочечные молекулы siRNA размером не более 28 нуклеотидов (иначе клетки ответят выработкой интерферона и снижением синтеза белка) и не менее 21 нукл. (снижается специфичность ее связывания с нужной мРНК и способность к формированию комплексов RISC).
На практике терапия siRNA встречается с затруднениями. Например, в случае антивирусной терапии именно высокая специфичность siRNA может сыграть злую шутку: как известно, вирусы обладают способностью быстро мутировать (в т.ч.ВИЧ). Существенный недостаток предполагаемой siRNA-терапии у человека – ее кратковременность. Ведь siRNA действуют не на сами гены, а только лишь на их продукты – молекулы мРНК, а у человека нет той системы усиления сигнала, которая присуща растениям и насекомым. Кроме того, двухцепочечные молекулы siRNA чрезвычайно неустойчивы и недолговечны, поэтому эффект терапии закончится, как только они разрушатся и будут выведены из клетки. Для того, чтобы терапия оказалась пролонгированной, необходимо вводить все новые siRNA.
Генная терапия пытается решить эту проблему, создавая специальные генетические конструкции на основе вирусных или бактериальных ДНК, в которые включены и гены, кодирующие необходимый для терапии тип siRNA. При попадании в клетку такие конструкции встраиваются в хромосомы, а гены siRNA превращаются в собственно молекулы siRNA с помощью клеточного механизма транскрипции. Таким образом, клетка сама получает возможность постоянно продуцировать новые и новые siRNA. Данные подходы уже опробованы и показали свою эффективность in vitro.
Но самым главным препятствием на пути разработки лекарств на основе siRNA являются сложности с их доставкой в клетки-мишени в пределах целого организма (срабатывают защитные ферменты-нуклеазы). И как заставить siRNA проникать только в больные клетки-мишени, не затрагивая при этом здоровые?
Природная роль
Геном любого многоклеточного организма включает в себя множество элементов, которые когда-то были привнесены в него в процессе эволюции извне, например, в результате встраивания вируса. Понятно, что каждому организму необходимо было разработать систему жесткого управления поведением мобильных генетических элементов. Как раз эту «надзирательскую» функцию, как полагают, и выполняет система внутриклеточных siRNA
Кроме того, ошибки в развитии органов и тканей у подопытных животных, обнаруживаемые при отключении генов, кодирующих систему siRNA, а также высокая активность системы siRNA в не дифференцированных клетках указывают на то, что механизм РНК-интерференции активно участвует в регуляции программы «созревания» клеток. Таким образом, процесс РНК-интерференции возможно играет одну из ключевых ролей в формировании целостного организма.
Еще одна из предполагаемых природных функций siRNA – выявление неправильно обработанных копий других типов РНК в клетке.
