Белоксинтезирующая система включает: набор всех 20 аминокислот, входящих в состав белковых молекул; минимум 20 разных тРНК, обладающих специфичностью к определенному ферменту и аминокислоте; набор минимум 20 различных ферментов - аминоацил-тРНК-синтетаз, также обладающих двойной специфичностью к какой-либо определенной аминокислоте и одной тРНК; рибосомы (точнее полисомы: состоящие из 4-12 монорибосом с присоединенной к ним матричной мРНК); АТФ и АТФ-генерирующую систему ферментов; ГТФ, принимающая специфическое участие в инициации и элонгации синтеза белка в рибосомах; ионы Mg2+ в концентрации 0,005-0,008 М; мРНК в качестве главного компонента системы, несущей информацию о структуре белка, синтезирующегося в рибосоме; наконец, белковые факторы, участвующие в синтезе на разном уровне трансляции.
Рибосомы. Живые организмы, как известно, в зависимости от структуры клеток делятся на две группы: прокариоты и эукариоты. Первые не содержат ограниченного мембраной ядра и митохондрий или хлоропластов; они представлены главным образом микроорганизмами. Клетки эукариот животных и растений, включая грибы, напротив, содержат ядра с мембранами, а также митохондрии (и в ряде случаев хлоропласты).
Оба типа клеток содержат рибосомы, причем рибосомы эукариот (клетки животных) примерно в два раза больше рибосом прокариот (бактерии). Обычно рибосомы характеризуют по скорости их седиментации в центрифужном поле, которая количественно выражается константой седиментации s, выражаемой в единицах Сведберга S. Величина s зависит не только от размера частиц, но и от формы и плотности, так что она не пропорциональна размеру. Число рибосом в микробной клетке примерно равно 104, а эукариот - около 105
Аминоацил-тРНК-синтетазы. Экспериментально доказано существование в любых клетках живого организма специфических ферментов, катализирующих активирование аминокислот и связывание последних с определенными тРНК. Все эти ферменты выделены в чистом виде из E. coli.
Молекулярная масса почти всех синтетаз равна 100 000 Да. Все они оказались чувствительными к реагентам на SH-группы и требуют присутствия ионов Mg2+. Ферменты обладают абсолютной специфичностью действия, поскольку они узнают только одну какую-либо L-аминокислоту или одну тРНК; это обстоятельство чрезвычайно важно, поскольку в дальнейшем в белковом синтезе "узнавание" аминоацил-тРНК основано не на природе аминокислоты, а на химической природе антикодона тРНК. Считается, что в молекуле каждой аминоацил-тРНК-синтетазы имеются по крайней мере три центра связывания: для аминокислоты, тРНК и АТФ; ферменты весьма чувствительны также к аналогам аминокислот, которые ингибируют активирование соответствующих аминокислот. Некоторые ферменты состоят из одной полипептидной цепи, другие из двух или четырех гомологичных или гетерогенных субъединиц.
Аминоацил-тРНК-синтетазы в активном центре содержат гистидин, имидазольное кольцо, которое участвует в связывании АТФ посредством ионов Mg2+. Наибольшим сродством эти ферменты, как было указано, обладают по отношению к молекулам специфических тРНК, хотя конкретный механизм, посредством которого ферменты узнают подходящую РНК, пока не ясен. В то же время эти ферменты отличаются низкой молярной активностью (число оборотов не превышает нескольких сот каталитических актов в минуту).
Транспортные РНК
Установлена первичная структура почти всех 60 открытых тРНК; знание последовательности, а следовательно, состава тРНК дало в руки исследователей много ценных сведений о биологической роли отдельных компонентов тРНК. Общей для тРНК оказалась также нативная конформация, установленная методом рентгеноструктурного анализа и названная первоначально конформацией клеверного листа; на самом деле эта конформация имеет неправильную, Г-образную форму.
Определение структуры тРНК позволило выявить ряд отличительных участков; так, на 3'-гидроксильном конце располагается одинаковая для всех тРНК последовательность триплета ЦЦА-ОН, к которой присоединяется посредством эфирной связи специфическая аминокислота. Связывание в основном происходит через 3'-ОН- группу концевого аденилового нуклеотида, хотя получены доказательства возможности присоединения аминокислоты через 2'-ОН- группу. Тимин-псевдоуридин-цитидиловая (Т(Ц) петля, по-видимому, связывает аминоацил-тРНК с поверхностью рибосомы. Имеется, кроме того, добавочная петля, состав которой варьируется у разных типов молекул тРНК; ее назначение неизвестно. Дигидроуридиловая петля, с другой стороны, оказалась необходимой как сайт (место) для узнавания специфическим ферментом - аминоацил-тРНК-синтетазой. Имеется также антикодоновая петля, несущая триплет, названный антикодоном, и расположенная на противоположной стороне от того конца, куда присоединяется аминокислота. Антикодон является специфичным и комплементарным к соответствующему кодону мРНК, причем оба они являются антипараллельными в своей комплементарности.
Тщательный анализ нуклеотидных последовательностей разных тРНК показал, что все они содержат одинаковый 5'-концевой нуклеотид - ГМФ со свободной 5'-фосфатной группой. Адапторная функция молекул тРНК заключается в связывании каждой молекулы тРНК со своей аминокислотой. Но поскольку между нуклеиновой кислотой и специфической функциональной группой аминокислоты не существует соответствия и сродства, эту функцию узнавания должна выполнять белковая молекула, которая узнает как молекулу специфической тРНК, так и специфической аминокислоты.
Этапы синтеза белка
Активирование аминокислот. Необходимым условием синтеза белка, который в конечном счете сводится к полимеризации аминокислот, является наличие в системе не свободных, а так называемых активированных аминокислот, располагающих своим внутренним запасом энергии. Активация свободных аминокислот осуществляется при помощи специфических ферментов аминоацил-тРНК-синтетаз в присутствии АТФ. Этот процесс протекает в две стадии, причем обе катализируются одним ферсентом. На первой стадии аминокислота реагирует с АТФ и образуется пирофосфат и промежуточный продукт, который на второй стадии реагирует с соответствующей 3'- ОН-тРНК, в результате чего образуется аминоацил -тРНК (аа-тРНК) и освобождается АМФ. Аминоацил-тРНК располагает необходимым запасом энергии. Необходимо подчеркнуть, что аминокислота присоединяется к концевому 3'- ОН-гидроксилу (или 2'-ОН) АМФ, который вместе с двумя остатками ЦМФ образует концевой ттриплет ЦЦА, являющийся одинаковым для всех транспортных РНК.
Процессы трансляции. Второй этап матричного синтеза белка, собственно трансляцию, протекающую в рибосоме, условно делят на три стадии: инициацию, элонгацию и терминацию.
Инициация трансляции. Стадия инициации, являющаяся "точкой отсчета" начала синтеза белка, требует соблюдения ряда условий, в частности наличия в системе помимо 70S или 80S рибосом, инициаторной аминоацил-тРНК, иницирующих кодонов в составе мРНК и белковых факторов инициации. Экспериментально доказано, что у бактерий, в частности у E. Coli, инициаторной является аа-тРНК, в образовании которой специфическое участие принимают соответстсвующая тРНК и N10-формил-тетрагидрофолиеая кислота. Таким образом, N-формилметионил-тРНК является первой аа-тРНК, которая определяет включение N-концевого остатка аминокислоты и тем самым начало трансляции.
Процесс формирования имеет важный химический и биологический смысл, предотвращая участие NH2-группы аминокислоты в образовании пептидной связи и обеспечивая тем самым синтез белка в направлении NH2 (COOH. Образовавшаяся формилметионил-тРНК, по-видимому, первой связывается в определенном участке с 30S субчастицей рибосомы и с мРНК. Помимо тРНКфМет, у E. Coli имеется обычная тРНК, акцептирующая свободный, а не формилированный метионин. Она обозначается тРНКМет и обеспечивает перенос метионина в процессе сборки (элонгации) полипептдной цепи. Необходимым условием инициализации является также наличие инициирующих кодонов, кодирующих формилметионин. У бактерий эту функцию выполняют триплеты АУГ и ГУГ мРНК. Однако эти триплеты кодируют формилметионин (или начальный метионин) только будучи начальными триплетами при считывании матричной мРНК. Если же эти триплеты являются обычными, т.е. внутренними, то каждый из них кодирует свою аминокислоту, в частности, АУГ-метионин и ГУГ-валин. Ясно, что инициаторный 5'-АУГ-кодону предшествует полипуриновая последовательность, которая узнается полипиримидиновой последовательностью
