Вміст кожної пробірки можна, крім того, всмоктати у пастерівські піпетки або трубки Віньяль-Вейона, стежачи, щоб не було бульбашок повітря. Останні мають довжину біля 30 см і діаметр 0,5-0,6 см. Верхній кінець їх, який закривається ватою, має перетяжку, а нижній витягнутий у вигляді капіляра. Після заповнення піпетки її витягнутий кінець запаюють і кладуть у термостат для культивування. Через 1-2 доби в агарі виростають колонії анаеробних бактерій. Для того щоб їх ізолювати, трубку надрізають напильником на певному рівні, розламують, колонію беруть бактеріальною петлею або голкою, переносять у відповідне середовище.
Для виділення ізольованих колоній за методом Цейсслера матеріал із середовища Кітта-Тароцці або молока наносять петлею або 1-2 краплі пастерівською піпеткою на чашку Петрі з цукрово-кров’яним агаром і роблять посів шпателем за методом Дригальського. Не стерилізуючи шпатель, засівають другу чашку, а потім і третю. Чашки перевертають догори дном, підписують, ставлять в анаеростат, в якому створюють анаеробні умови, а потім – у термостат при температурі 37 °С на 2-3 доби. На останній чашці виростають ізольовані колонії.
Третій етап дослідження починається з вивчення морфологічних особливостей колоній, які виросли в чашках Петрі або трубках Віньяль-Вейона. Досліджуються їх форма, величина, колір, характер країв, рельєф колонії, консистенція тощо. З колоній готують мазки, фарбують їх за методом Грама. Після цього колонії відсівають у середовище Кітта-Тароцці для одержання чистої культури. Посіви інкубують певний час при оптимальній температурі.
На четвертому етапі звертають увагу на особливості росту чистої культури збудників на відповідних середовищах, перевіряють її на чистоту і проводять ідентифікацію. Ідентифікують виділені чисті культури анаеробних мікроорганізмів подібно до аеробних за морфологічними, культуральними, біохімічними та біологічними ознаками. Обов’язково використовують визначення токсигенних властивостей збудників у біологічниій пробі та реакції нейтралізації на лабораторних тваринах. У деяких випадках визначають антигенні властивості мікроорганізмів.
Таким чином, на підставі вивчення різноманітних властивостей мікроорганізмів робиться висновок про належність їх до того чи іншого виду.
Середовища для культивування анаеробних мікроорганізмів
Середовище Кітта-Тароцці готують на основі бульйону Хоттінгера, до якого додають шматочки бичачої печінки або мяса. Стерилізують його при 1 атмосфері протягом 30 хв. Активна реакція середовища – 7,4-7,6. Після посіву матеріалу середовище заливають зверху шаром вазелінової олії товщиною до 1 см.
Анаеробний кров’яний агар готують на основі еритрит-агару. До його складу входять також спеціальні добавки: середовище 199 (10 %), гемін (10 мкг/мл), твін-80 (0,1 %), метадіон (10 мкг/мл), цитратна кров (до 5 %) тощо. Після стерилізації його розливають у чашки Петрі. Використовують не пізніше, як через 2 год після виготовлення.
Жовтковий агар. У розтоплене і охолоджене до 56-60 °С середовище на основі еритрит-агару додають суспензію курячого жовтка (20 %), глюкозу (0,2 %), гемін (10 мкг/мл) і розливають у чашки Петрі. Середовище використовують для визначення лецитиназної активності збудників, зокрема C. perfringens. При наявності лецитинази навколо колоній утворюються зони помутніння.
Комерційне середовище для контролю стерильності. Його можна використовувати як транспортне. Для поліпшення росту анаеробних бактерій до його складу можна вводити спеціальні добавки, такі як середовище 199, гемін, твін-80, метадіон, цитратна кров тощо.
Середовище Вільсон-Блера. Його готують на основі розтопленого й охолодженого до 60 °С 1 % цукрового (глюкоза) МПА рН 7,4 з додаванням на 100 мл 10 мл стерильного 20 % розчину сульфіту натрію і 1 мл 8 % розчину хлориду заліза. Готове середовище не стерилізують.
Його використовують для прискореної діагностики газової анаеробної інфекції, викликаної Clostridium рerfringens. Вже через 1-2 год спостерігають зміну середовища: воно чорніє внаслідок відновлення сульфіту натрію в сульфат, який взаємодіє з хлоридом заліза, утворюючи сульфід заліза. З’являються також розриви агару внаслідок інтенсивного газоутворення.
Лакмусове молоко. Готують середовище із свіжого молока. Попередньо його кип’ятять і залишають у прохолодному місці на одну добу. Знімають верхній шар жиру і процедуру повторюють. Молоко фільтрують, і 10 % розчином бікарбонату натрію доводять рН до 7,2. Перед стерилізацією до молока додають 5-10 % лакмусової настойки та ідентичну кількість 10 % розчину бікарбонату натрію, щоб піна молока набула синьо-фіолетового відтінку. При підлужуванні молока воно стає синьо-фіолетовим, при підкислюванні – рожевим аж до червоного.
Ідентифікація мікроорганізмів за допомогою бактеріофагів
Бактеріофаги мають виражену літичну дію на мікроорганізми. Цю особливість використовують для визначення їх виду. З цією метою у дві пробірки з м’ясо-пептонним бульйоном засівають досліджувану культуру бактерій. Потім в одну з них додають декілька крапель індикаторного фага. Пробірки інкубують при оптимальній температурі протягом 18-24 год. Порівнюють мутність бульйону в контрольній та дослідній пробірці і роблять висновок про чутливість мікроорганізмів до літичної дії бактеріофагів.
Літична дія бактеріофагів
Можна з цією метою використати щільне живильне середовище, на яке газоном засівають досліджувану культуру бактерій. Після підсушування чашок на них бактеріологічною петлею або пастерівською піпеткою наносять краплю відповідного розведення бактеріофагу, яке вказане на ампулі. Посіви інкубують в термостаті при 37 °С протягом 18-24 год і фіксують наявність прозорих круглих плям, які свідчать про літичну дію бактеріофагу. Позитивний результат свідчить про належність бактерій до певного виду.
Фаготипування мікроорганізмів проводять з метою аналізу епідеміологічної ситуації для визначення джерела інфекції. Найчастіше його виконують при діагностиці стафілококових, кишкових та інших інфекцій.
В основі тесту лежить визначення фаговаріантів (фаговарів) збудників. Для цього дно чашки з м’ясо-пептонним агаром за числом бактеріофагів поділяють на квадрати. Вирощують чотиригодинну бульйонну культуру досліджуваного штаму і 1 мл її засівають на поверхню середовища. Розподіляють рівномірно культуру по поверхні середовища і надлишок її зливають. Чашку підсушують у термостаті при 37 °С протягом 30-40 хв і на поверхню агару в кожний квадрат капають піпеткою бактеріофаги відповідних розведень. Посіви ставлять у термостат або залишають при кімнатній температурі протягом 18-20 год, після чого оцінюють результати. Облік результатів проводять на темному фоні за допомогою лупи. Залежно від ступеня чутливості культури до бактеріофагів виділяють різні ступені лізису бактерій, який оцінюється за чотириплюсовою системою: від лізису, який зливається до його відсутності.
