На підставі вивчення морфологічних, культуральних, біохімічних, антигенних, біологічних та інших властивостей мікробів роблять остаточний висновок про ідентифікацію. Наприклад: “Виділено Escherichia coli” або “Виділений збудник належить до виду Staphylococcus epidermidis”.
Виділення чистої культури анаеробних бактерій
У лабораторній практиці часто доводиться працювати з анаеробними мікроорганізмами. Вони більш вибагливі до живильних середовищ, ніж аероби, частіше потребують спеціальних ростових добавок, вимагають припинення доступу кисню при їх культивуванні, тривалість росту їх довша. Тому робота з ними складніша, вимагає значної уваги бактеріологів і лаборантів.
Важливим є захист матеріалу, що містить анаеробні збудники від токсичного впливу атмосферного кисню. Тому матеріал із вогнищ гнійної інфекції рекомендується забирати під час їх пункції за допомогою шприца, час між взяттям матеріалу та посівом його на живильне середовище повинен бути максимально коротким.
Оскільки для культивування анаеробних бактерій використовують спеціальні живильні середовища, які не повинні містити кисню і мають низький окисно-відновний потенціал (-20 -150 мВ), до їх складу вводять індикатори – резазурин, метиленовий синій тощо, які реагують на зміну цього потенціалу. При його зростанні відновлені безбарвні форми індикаторів змінюють свій колір: резазурин забарвлює середовище в рожевий колір, а метиленовий синій – в голубий. Такі зміни свідчать про неможливість використання середовищ для культивування анаеробних мікробів.
Сприяє зниженню окисно-відновного потенціалу введення в середовище не менше 0,05 % агару, який, збільшуючи його в’язкість, сприяє зменшенню надходження кисню. Це, в свою чергу, досягається ще й використанням свіжих (не пізніше двох годин після виготовлення) і редукованих живильних середовищ.
Слід врахувати, що через особливості бродильного типу метаболізму анаеробних бактерій вони вимагають багатших на живильні компоненти і вітаміни середовищ. Найчастіше використовують серцево-мозковий й печінковий настої, соєві та дріжджові екстракти, гідролітичний перевар казеїну, пептон, триптон. Обов’язковим є додавання факторів росту, таких як твін-80, гемін, менадіон, цільна або гемолізована кров.
Методи створення анаеробних умов. Враховуючи, що вільний молекулярний кисень є токсичним для облігатно-анаеробних бактерій, обов’язковою умовою культивування таких мікроорганізмів є обмеження його доступу. Існує ряд методів (механічних, фізичних, біологічних), які дозволяють це забезпечити.
Фізичні методи. 1. Перед посівом бактерій на живильне середовище його обов’язково регенерують для видалення надлишку розчиненого кисню. З цією метою середовище кип’ятять протягом 15-20 хв на водяній бані, а потім швидко охолоджують до необхідної температури.
2. Для попередження проникненя кисню в середовище його заливають шаром стерильної вазелінової олії або парафіном.
3. Стовпчик живильного середовища у пробірках повинен бути достатньо високим (10-12 см). Кисень, як правило, дифундує в товщу стовпчика на глибину до 2 см, тому нижче створюються сприятливі умови для культивування анаеробних мікробів.
4. Евакуаційно-замісний метод полягає у використанні анаеростатів. Вони представляють собою герметичні металеві або пластмасові банки, з яких можна викачати кисень і замінити його інертним газом (гелій, азот, аргон).
Допускається використання трикомпонентної газової суміші, яка складається з 80 % азоту, 10 % диоксиду вуглецю та 10 % водню. Деколи допустимим вважається використання природного газу. Для поглинання кисню, який залишається в анаеростаті, використовують паладієві каталізатори. З метою поглинання водяної пари використовують хлорид кальцію, силікагель тощо, які поміщають на дно анаеростата.
Хімічні методи. 1. Використання речовин, здатних поглинати кисень. З цією метою допустимим є застосування лужного розчину пірогалолу. При цьому враховують поглинаючу активність речовини: на 100 мл ємності герметичної посудини, в якій знаходяться чашки Петрі, використовують 1 г пірогалолу і 10 мл 2,5 N розчину гідроксиду натрію.
Киснезв’язуючий ефект має також гідросульфіт натрію (Na2S2O4). Для зв’язування кисню в 1 л повітря використовують суміш, яка складається з 100 мл свіжого 20 % розчину Na2S2O4 і 16 мл 50 % гідроксиду калію.
2. Застосування речовин-редуцентів. Враховуючи, що ріст облігатно-анаеробних бактерій відбувається в середовищах з низьким рівнем окисно-відновного потенціалу, до них додаються спеціальні відновлювачі: цистеїн (0,03-0,0,5 %), тіогліколеву кислоту або тіогліколат натрію (0,01-0,02 %), сульфід натрію, аскорбінову кислоту (0,1 %), різноманітні цукри.
Функції відновлювачів можуть виконувати шматочки паренхіматозних органів тварин (печінка, нирки, серце) або навіть рослин (картопля, інші коренеплоди).
Ступінь поглинання кисню або ступінь відновлення середовища вимірюють або електрометрично або за допомогою індикаторів (резазурин, нейтральний червоний, феносафранін).
3. Використання спеціальних газогенеруючих систем, які дозволяють створити безкисневі умови в мікроанаеростатах, транспортних пластикових пакетах тощо. Однією з найпоширеніших є система “Gas Generating Box”.
