А План
А Программа
1. Биологические свойства возбудителей нейровирусных инфекций, их патогенность, экология, особенность инфекций и эпидемиология вызываемых заболеваний.
2. Микробиологическая диагностика.
3. Диагностические и лечебно-профилактические препараты.
А Демонстрация
1. Тельца Негри при бешенстве.
2. Электронно-микроскопические фотографии нейрови-русов.
3. Диагностические и лечебно-профилактические препараты.
А Задания студентам
1. Указать материал для исследования при нейровирусных инфекциях.
2. Ознакомиться с бланками-направлениями на исследование материала в вирусологическую лабораторию.
3. Сделать выводы по результатам реакции нейтрализации выделенного от больного вируса с моновалентными иммунными сыворотками против вирусов полиомиелита I, II и III типов.
4. Оценить результаты реакции нейтрализации выделенного вируса моновалентными иммунными сыворотками против вирусов ECHO серотипов 9—16.
5. Оценить результаты реакции нейтрализации с парными сыворотками крови больного и антигенами вирусов Коксаки для серодиагностики.
6. 
Учесть результаты РСК с парными сыворотками больного энцефалитом и обосновать диагноз заболевания.
7. Учесть результаты РСК с парными сыворотками больного для серодиагностики полиомиелита.
8. Ознакомиться с диагностическими и лечебно-профилактическими препаратами, указать механизм действия.
А Методические указания
• Микробиологическая диагностика инфекций, вызванных энтеровирусами (полиовирусы, вирусы Коксаки и ECHO)
МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: смывы из зева (первые дни болезни), фекалии; спинномозговая жидкость (при менингите).
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:
Вирусологическое исследование. Является ведущим методом диагностики энтеровирусных инфекций. Выделение энтерови-русов (за исключением вирусов Коксаки типа А) из исследуемого материала осуществляют путем заражения клеточных культур. Для уничтожения сопутствующей бактериальной микрофлоры нестерильный материал (испражнения, глоточные смывы) предварительно обрабатывают антибиотиками (смесь пенициллина со стрептомицином, содержащая по 1000 ЕД/мл каждого антибиотика в растворе Хенкса) в течение суток при 4 °С, после чего проводят контрольный посев на стерильность. При сохранении бактериальной флоры материал повторно обрабатывают теми же антибиотиками. Затем одновременно заражают по 2—3 пробирки с первичной (эмбриональные фиб-робласты человека или клетки почек обезьян) и перевиваемой культурой клеток (HeLa, амниона человека или др.), поскольку одни серотипы энтеровирусов лучше репродуцируются в первичных, другие — в перевиваемых клетках.
Индикацию вирусов проводят по ЦПД: на 2—3-й день инкубации при 35 °С наблюдается полная или частичная дегенерация клеток. При этом интенсивность ЦПД зависит от дозы вируса, типа культуры клеток и других причин. В случае отсутствия ЦПД проводят дополнительно 2—3 пассажа. Основным методом идентификации выделенного вируса является серотипирование в реакции нейтрализации (табл. 19.1.1; 19.1.2; 19.1.3). С этой целью материал из чистой культуры выделенного вируса обрабатывают смесью диагностических моновалентных сывороток к различным серотипам энтеровирусов. При нейтрализации вируса в последующих пересевах ЦПД исчезает. Затем проводят реакцию нейтрализации с моновалентными сыворотками. При этом в начале определяют тип вируса (полиовирус, Коксаки или ECHO), а затем его принадлежность к определенному серотипу.
Таблица 19.1.1. Результаты реакции нейтрализации выделенных от больных вирусов с моновалентными иммунными сыворотками к вирусам полиомиелита I—III типов
| Сыворотка к вирусам полиомие- | Наличие ЦПД | Тип выделенного вируса | ||||||
| исследуемый материал | контроль сыво- | |||||||
| 2-й | 3-й | 4-й | 5-й | 6-й | 7-й | миелита | ||
| день | день | день | день | день | день | ротки | ||
| I II — — + +++ ++++ | ++++ | I | ||||||
| III — — ++ +++ ++++ | ++++ | — | ||||||
| Контроль — + ++ +++ ++++ | ++++ | |||||||
| вируса |
Условные обозначения: (++++) —выраженная дегенерация клеток с их отслаиванием от стенок пробирки; (+++) — менее выраженная дегенерация клеток с частичным отслаиванием от стенок пробирки; (+.+) — наличие не более 50 % дегенерированных клеток; (+) — наличие одиночных дегенерированных клеток; (—) — отсутствие ЦПД.
Таблица 19.1.2. Результаты реакции нейтрализации вьщеленных от больных вирусов с моновалентными иммунными сыворотками к вирусам Коксаки
| Сыворот- | Наличие ЦПД | Тип | ||||||
| сам Коксаки | исследуемый материал | контроль сыворотки | го вируса Коксаки | |||||
| 2-й день | 3-й день | 4-й день | 5-й день | 6-й день | 7-й день | |||
| В-1 | — | + + | +++ | ++++ | ++++ | — | ||
| В-2 | — | ++ +++ | +++ | ++++ | ++++ | — | ||
| В-3 | — | — — | — | — | — | — | Коксаки В-3 | |
| В-4 | — | + + + | +++ | ++++ | +++ + | __ | ||
| В-5 | — | ++ + + | +++ | ++++ | + + + + | — | ||
| В-6 | — | + ++ | +++ | ++++ | ++ + + | — | ||
| Контроль вируса | — | ++ +-Н- | +++ | ++++ | +++ + | — | ||
Условные обозначения: те же, что и в табл. 19.1.1.
Некоторые энтеровирусы (вирусы ECHO серотипов 3, 6, 7; Коксаки А серотипов 20 и 21; Коксаки В серотипов 1 и 5) обладают гемагглютинирующими свойствами. Их идентифицируют в РТГА. Для идентификации применяют и другие методы (ИФ, ИФА, метод ДНК-зондов и др.).
 |  | ||
|
Необходимо помнить, что положительный результат вирусологического исследования имеет абсолютную диагностическую ценность только в случае выделения вируса из стерильного материала (спинномозговая жидкость, кровь, биоптаты органов), поскольку бессимптомное носительство широко распространено (до 50 % здорового населения). При обнаружении вируса в испражнениях или глоточных смывах необходимо серологическое подтверждение диагноза.
Биопроба. Для выделения вирусов Коксаки А, которые плохо репродуцируются в культурах клеток, применяют биопробу — исследуемым материалом заражают новорожденных белых мышей. В положительном случае у зараженных животных на 3—5-й день развиваются вялые параличи. Идентификацию этих вирусов проводят в РН на новорожденных мышах с моновалентными диагностическими сыворотками против различных серотипов вирусов Коксаки А.
Экспресс-методы диагностики. Молекулярно-биологи-ческие исследования. РНК вирусов в исследуемом материале обнаруживают методом гибридизации НК (ДНК-зондов).
Серодиагностика. С диагностической целью в крови больных определяют наличие специфических противовирусных иммуноглобулинов класса М (IgM) с помощью ИФА. Для ретроспективного подтверждения диагноза применяют также метод парных сывороток. С этой целью кровь у больного берут дважды: в первые дни болезни и через 3—4 нед. Раннюю сыворотку сохраняют в холодильнике и реакцию ставят одновременно с обеими сыворотками. Антитела определяют в реакции нейтрализации в культуре клеток с эталонными штаммами энтеровирусов, принадлежащих к тем серотипам, которые чаще всего выделяют от больных (табл. 19.1.4). Для серодиагностики заболеваний, вызванных гемагглютинирующими вирусами Коксаки, используют РТГА. Диагностическое значение имеет нарастание титра антител в поздней сыворотке не менее чем в 4 раза. При обнаружении антител, соответствующих серотипу выделенного вируса, диагноз считается подтвержденным.
• Микробиологическая диагностика весенне-летнего клещевого энцефалита
МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь.
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:
Серодиагностика. Обнаружение противовирусных антител в крови больного является основным методом диагностики клещевого энцефалита, поскольку к моменту появления симптомов заболевания период вирусемии заканчивается. Выделение вируса из спинномозговой жидкости редко бывает успешным. Для серодиагностики применяют метод парных сывороток. Используют РН, РСК, РТГА, реакцию латекс-агглютинации, ИФА и другие
реакции со стандартными вирусными антигенами. Диагностическое значение имеет нарастание титра специфических антител не менее чем в 4 раза. Оценку результатов производят с учетом анамнестических данных: вакцинация, пассивная иммунизация (введение противоэнцефалитной сыворотки или иммуноглобулина).
Экспресс-методы диагностики: иммунохимические и молеку-лярно-биологические исследования. Иммунохимические исследования. С целью экспресс-диагностики клещевого энцефалита применяют методы определения зараженности клеща, извлеченного из места укуса. Основным методом является ИФ. Готовят мазки-отпечатки и обрабатывают флюоресцирующими антителами к антигенам вируса клещевого энцефалита. В положительном случае наблюдается специфическое свечение скоплений вирусных антигенов внутри клеток, присутствующих в материале. Наличие антигенов вируса в организме клеща можно определить и с помощью других иммунологических методов (РНГА со взвесью исследуемого материала и эритроцитами, нагруженными антителами к вирусу клещевого энцефалита, ИФА и др.). Предварительный ответ получают спустя 2-3 ч.
