И образуемых в биотехнологических процессах продуктов (по Виестур и др., 1987)

Субстраты Биологические агенты Продукты

Меласса, сок сахарного тро-

стника, гидролизаты расти-

тельных полимеров.

Микроорганизмы, расти-

тельные и животные клетки,

в том числе потической ин-

женерии.

Биоудобрения и биоинсекти-

циды, микробные биомассы,

диагностикумы, вакцины.

Сахара, спирты,

органические кислоты.

Парафины нефти.

Полупродукты,

предшественники

биотрансформации.

Природный газ,

водород.

Отходы с/х и лесной

промышленности.

Отходы промышленности,

в том числе переработки

фруктов и овощей.

Бытовые отходы,

сточные воды.

Молочная сыворотка.

Картофель, зерно.

Зеленая биомасса растений.

Вирусы.

Компоненты клеток:

мембраны, протопласты,

митохондрии, ферменты.

Внеклеточные продукты:

ферменты, коферменты.

Иммобилизованные клетки

микроорганизмов, растений

и животных, их компоненты

и внеклеточные продукты.

Биогаз.

Чистые продукты,

медикаменты, диагностикумы.

Гормоны и др. продукты

биотрансформации

Органические кислоты.

Полисахариды.

белок одноклеточных.

Пищевые продукты.

Экстракты, гидролизаты.

Спирты,

органические растворители.

Антибиотики

Аминокислоты.

Ферменты, витамины.

Металлы, неметаллы.

Моноклональные антитела.

биологических микроустройств для использования в аналитике, преобра-

зовании энергии и биоэлектрокатализе.

К нетрадиционным биологическим агентам на данном этапе развития

биотехнологии относят растительные и животные ткани, в том числе гиб-

ридомы, трансплантанты. Большое внимание в настоящее время уделяется

получению новейших биологических агентов – трансгенных клеток мик-

роорганизмов, растений, животных генноинженерными методами. Разви-

ты также новые методы, позволяющие получать искусственные клетки с

использованием различных синтетических и биологических материалов

(мембраны с заданными свойствами, изотопы, магнитные материалы, ан-

титела). Разрабатываются подходы к конструированию ферментов с за-

данными свойствами, имеющими повышенную реакционную активность и

стабильность. В настоящее время реализован синтез полипептидов желае-

мой стереоконфигурации и пр.

Таким образом, в биотехнологических процессах возможно использо-

вание различных биологических агентов с различным уровнем организа-

ции, – от клеточной до молекулярной.

Субстраты и среды, используемые в биотехнологии, весьма разнооб-

разны, и их спектр непрерывно расширяется (табл. 1.2). С развитием про-

мышленных процессов происходит накопление новых видов отходов, ко-

торые могут быть обезврежены и конвертированы в полезные продукты

методами биотехнологии. С одной стороны, развивающиеся бурными тем-

пами биотехнологические промышленные направления сталкиваются с

проблемой исчерпания традиционных видов сырья, поэтому возникает

необходимость в расширении сырьевой базы, с другой, – увеличение объ-

емов накапливающихся отходов делает необходимым разработку нетра-

диционных, в том числе биотехнологических способов их переработки.

В настоящее время наблюдается рост интереса биотехнологов к при-

родным возобновляемым ресурсам – продуктам фотосинтеза, биоресурсам

мирового океана. В состав сред для биотехнологических процессов входят

источники углерода и энергии, а также минеральные элементы и ростовые

факторы. В качестве источников углерода и энергии в биотехнологиче-

ских процессах используют главным образом природные комплексные

среды неопределенного состава (отходы различных производств, продук-

ты переработки растительного сырья, компоненты сточных вод и пр.), в

которых помимо углеродных соединений содержатся также минеральные

элементы и ростовые факторы. Довольно широко включены в разряд био-

технологических субстратов целлюлоза, гидролизаты полисахаридов и

древесины. Последние около 30 лет используют для получения белка од-

ноклеточных. Кислотный гидролиз древесины при 175–190°С обеспечива-

ет выход в среду до 45–50 % редуцирующих веществ; при более жестких

режимах гидролиза эта величина возрастает до 55–68 %. С большим успе-

хом в последние годы стали применять гидролизаты торфа, это позволяет

снизить стоимость, например, препаратов аминокислот в 4–5 раз. Мине-

ральные элементы, необходимые для роста биологических агентов и вхо-

дящие в состав питательных сред, подразделяются на макро- и микроэле-

менты. Среди макроэлементов на первом месте стоит азот, так как по-

требности в нем у биологических объектов на порядок превышают по-

требности в других элементах (фосфоре, сере, калии и магнии). Азот

обычно используется микроорганизмами в восстановленной форме (моче-

вина, аммоний или их соли). Часто азот вводится в комплексе с другими

макроэлементами – фосфором, серой. Для этого в качестве их источников

используют соли (сульфаты или фосфаты аммония). Для ряда отдельных

продуцентов, однако, лучшими являются нитраты или органические со-

единения азота. Существенное значение при обеспечении азотного пита-

ния продуцента имеет не только вид, но концентрация азота в среде, так

как изменение соотношения C:N, воздействуя на скорость роста проду-

цента, метаболизм, вызывает сверхсинтез ряда целевых продуктов (ами-

нокислот, полисахаридов и др.). Минеральные элементы необходимы для

роста любого биологического агента, но их концентрация в среде в зави-

симости от биологии используемого биообъекта и задач биотехнологиче-

ского процесса различна. Так, концентрация макроэлементов в среде (K,

Mg, P, S) обычно составляет около 10–3–10–4 М. Потребности в микроэле-

ментах невелики, и их концентрация в средах существенно ниже – 10–6–

10–8 М. Поэтому микроэлементы часто специально не вносят в среде, так

как их примеси в основных солях и воде обеспечивают потребности про-

дуцентов. Отдельные продуценты в силу специфики метаболизма или пи-

тательных потребностей нуждаются для роста в наличие в среде ростовых

факторов (отдельных аминокислот, витаминов и пр.). Помимо чистых ин-

дивидуальных веществ такой природы, на практике часто используют в

качестве ростовых добавок кукурузный или дрожжевой экстракт, карто-

фельный сок, экстракт проростков ячменя, зерновых отходов и отходов

молочной промышленности. Стимулирующее действие данных ростовых

факторов во многом зависит от индивидуальных свойств применяемого

продуцента, состава основной среды, условий ферментации и др. Добав-

ление ростовых факторов способно увеличить выход целевого продукта,

например ферментов, в десятки раз.

Традиционно состав питательной среды, оптимальной для биотехноло-

гического процесса, определяется методом длительного эмпирического

подбора, в ходе которого на первых этапах определяется качественный и

количественный состав среды. Было сделано много попыток обоснования

состава сред с позиций физиологии и биохимии продуцента, но так как

потребности в питательных веществах видо- и даже штаммоспецифичны,

в каждом конкретном случае приходится подбирать оптимальный для кон-

кретного продуцента состав среды. В последние 20–25 лет все шире ис-

пользуют математический метод планирования экспериментов, математи-

ческое моделирование биотехнологических процессов; это позволяет

обоснованно подходить к конструированию питательных сред сделать их

экономичными.

Аппаратура. Вопросами технического обеспечения биотехнологиче-

ских процессов занимается биоинженерия. Для различных процессов су-

ществует огромное разнообразие аппаратуры: собственно для процесса

ферментации, а также для выделения и получения готового продукта.

Наиболее сложна и специфична аппаратура для ферментационной стадии.

Технически наиболее сложным процессом ферментации является аэроб-

ный глубинный стерильный и непрерывный (или с подпиткой субстра-

том). Аппараты для поверхностной и анаэробной ферментации менее

сложны и энергоемки. В современной литературе описаны сотни биореак-

торов, отличающихся по конструкции, принципу работы и размерам (от

нескольких литров до нескольких тысяч кубометров). Многочисленность

методов культивирование, чрезвычайное многообразие используемых

биологических агентов привели к огромному разнообразию конструктив-

ных решений, которые зависят от ряда факторов: типа продуцента и сре-

ды, технологии и масштабов производства, а также целевого продукта и

пр. Техническое оснащение биотехнологии базируется на общих положе-

ниях технической биохимии и пищевой технологии, однако имеет свою

специфику. Принципиальное отличие биотехнологических процессов от

чисто химических заключается в следующем:

– чувствительность биологических агентов к физико-механическим

воздействиям;

– наличие межфазового переноса веществ (по типу «жидкость – клет-

ки», «газ – жидкость – клетки»);

– требования условий асептики;

– низкие скорости протекания многих процессов в целом;

– нестабильность целевых продуктов;

– пенообразование;

– сложность механизмов регуляции роста и биосинтеза.

Рассмотрим некоторые типы ферментационных аппаратов.

Аппараты для анаэробных процессов достаточно просты и применяют-

ся в процессах конверсии растительного сырья, в том числе растительных

отходов, а также различных промышленных отходов. При метановом бро-

жении для получения биогаза, а также в ряде других процессов (получе-

ние ацетона, шампанских вин) используют ферментационные аппараты

(метанотенки). Эти аппараты имеют различную конструкцию (от простой

выгребной ямы до сложных металлических конструкций или железобе-

тонных сооружений) и объемы (от нескольких до сотен кубометров)

(рис.1.5). Метановые установки оборудованы системой подачи сырья,

системой теплообменах труб для стабилизации температуры, несложным

перемешивающим устройством для гомогенного распределения сырья и

биомассы продуцента, газовым колпаком и устройством переменного

объема (газгольдер) для сбора образуемого биогаза.

Конструкция аппаратов для аэробной ферментации определяется ти-

пом ферментации и сырья. Аппараты для аэробной поверхностной фер-

ментации, широко применяемые для производства органических кислот и

ферментов, достаточно просты по конструкции и, соответственно, подраз-

деляются на жидкофазные и твердофазные. Поверхностная жидкофазная

ферментация протекает в так называемых бродильных вентилируемых

камерах, в которых на стеллажах размещены плоские металлические кю-

веты. В кюветы наливают жидкую питательную среду, высота слоя со-

ставляет 80–150 мм, затем с потоком подаваемого воздуха среду инокули-

руют спорами продуцента. В камере стабилизируется влажность, темпера-

тура и скорость подачи воздуха. После завершения процесса культураль-

ная жидкость сливается из кювет через вмонтированные в днища штуцера

и поступает на обработку. При твердофазной ферментации процесс также

протекает в вентилируемых камерах, но вместо кювет на стеллажах раз-

мещают лотки, в которые насыпают сыпучую твердую среду слоем 10–15

мм. Для лучшей аэрации среды подаваемый в камеру воздух проходит

через перфорированное днище лотков.

Аппараты для аэробной глубинной ферментации наиболее сложны как

конструкционно, так и с точки зрения их эксплуатации. Главная задача,

возникающая при их конструировании, – обеспечение высокой интенсив-

ности массо- и энергообмена клеток со средой. Массообмен определяется

транспортом (переносом) кислорода и других биогенных элементов из

среды в микробную клетку и отводом из нее продуктов обмена. Главным

показателем массообменных характеристик ферментера служит коэффи-

циент массопередачи кислорода, так как кислород является основным ли-

3 4

отходы

биогаз

Рис. 1.5. Схема метановой установки.

1 – дозирующее устройство, 2 – теплообменник, 3 – метанотенк; 4 – газгольдер.

митирующим фактором аэробных ферментационных процессов. Расход

кислорода на образование 1 кг биомассы в зависимости от типа углерод-

содержащего сырья и степени его восстановленности может составлять от

0.75 до 5.00 кг. Клетки способны утилизировать кислород только в рас-

творенном виде, поэтому необходимо постоянно поддерживать его кон-

центрацию в культуре на уровне, оптимальном для конкретного проду-

цента. При этом скорость поступления кислорода к клеткам должна пре-

вышать скорость его включения в клетки, и в околоклеточном простран-

стве не должно возникать так называемых «концентрационных ям». Кро-

ме этого, концентрация клеток и растворенного субстрата должны быть

равномерными по всему объему ферментера. Поэтому перемешивание

является также одним из основных факторов, обеспечивающих требуемую

гидродинамическую обстановку в аппарате. При интенсивном перемеши-

вании пузырьки воздуха дробятся в аппарате и диспергируясь увеличива-

ют площадь контакта фаз «среда-клетка». Однако чрезмерное перемеши-

вание может вызвать механическое повреждение биологических объектов.

К настоящему времени разработано и применяется огромное количест-

во разнообразнейших перемешивающих и аэрирующих устройств, и клас-

сифицировать их практически невозможно. Наиболее удачна, по нашему

мнению, попытка классификации ферментационных аппаратов для аэроб-

ной глубинной ферментации по подводу энергии (Виестур ______и др., 1986;

1987). Согласно этой классификации, аппараты такого типа делятся на три

группы по подводу энергии: 1) – к газовой фазе, 2) – к жидкой фазе, 3) –

комбинированный подвод.

Ферментеры с подводом энергии к газовой фазе (группа ФГ). Их

общий признак – подвод энергии в аппарат через газовую фазу, которая

является ее носителем. Ферментеры характеризуются достаточно простой

конструкцией (отсутствуют трущиеся, движущиеся узлы), высокой экс-

плуатационной надежностью, но имеют не очень высокие массообменные

характеристики (коэффициент массопередачи кислорода менее 4 кг/м3)

(рис. 1.6). Данные аппараты представляют собой вертикальную емкость,

снабженную газораспределительным устройством одного из известных

типов. Барботажные газораспределительные устройства обычно устанав-

ливаются в нижней части аппарата. Подаваемый сверху через распредели-

тельную трубу воздух, пройдя через барботер, насыщает кислородом тол-

щу среды. Коэффициент массопереноса кислорода невысок, 1–2 кг/м3 ч;

барботажно-колонный – в нижней части корпуса такого аппарата устанав-

ливается перфорированная пластина с диаметром отверстий 0.0005 м или

сопловой эжектор с диаметром сопла 0.004 м; барботажно-эрлифтный

аппарат характеризуется наличием внутри одного или нескольких диффу-

зо

в) Воздух

а) Воздух

Воздух

б)

Воздух

г)

Воздух

д)

Воздух

е)

Рис. 1.6. Ферментеры с подводом энергии газовой фазой (группа ФГ) (Виестур и др., 1986).

а) барботажный: 1 – корпус, 2 – воздухораспределитель, 3 – карман, 4 коллектор, б) барботажный колон-

ный: 1 – корпус, 2 – рубашка, 3 – воздухораспределитель, в) барботажно-эрлифтный: 1 – корпус, 2 – диф-

фузор-теплообменник, 3 – воздухораспределитлье; г) газлифтный: 1 – корпус,2 – диффузор, 3 – дисперга-

тор,

4 – воздухораспределитель, 5 – теплообменник, д) трубчатый: 1 – пеногаситель, 2 – емкость, 3 – дисперга-

тор, 4 – корпус, 5 – распределительная перегородка, е) с плавающей насадкой: 1 – рубашка, 2 – тарелка,

3 – насадка, 4 – корпус.

а)

3 1

Воздух

б)

Воздух

в)

г)

Рис. 1.7. Ферментеры с вводом энергии жидкой фазой (группа ЖФ) (Виестур и др. 1986).

а) – с самовсасывающей мешалкой: 1 – корпус, 2 – мешалка, 3 – циркуляционный контур-теплообменник,

б) – эжекционный: 1 – корпус, 2 – насос, 3 – эжектор, в) – струйный с затопленной струей: 1 – эжектор, 2 –

теплообменник, 3 – корпус, 4 – насос, 5 – рассекатель, 6 – труба с насадкой, г) – струйный с плавающей

струей: 1 – теплообменник, 2 – насос, 3 – корпус, 4 – эжектор.

ров («стаканов») или нескольких перегородок для принудительного раз-

деления восходящих и нисходящих потоков циркулирующей жидкости;

эти элементы расположены равномерно по сечению аппарата или концен-

трично; газлифтный колонный ферментер состоит из двух колонн разного

диаметра, соединенных между собой; одна представляет собой барботаж-

ную колонну с восходящим потоком воздуха, другая – циркуляционная, с

нисходящим потоком. Воздух вводится в нижнюю зону аппарата в барбо-

тажную колонну; камера, соединяющая колонны в верхней части аппара-

та, образует большую поверхность контакта фаз; трубчатый аппарат скон-

струирован по типу теплообменных труб; взаимодействие газа в трубе при

высоких скоростях продувки более интенсивное, чем в большом объеме,

поэтому массообмен интенсивнее; аппарат с плавающей насадкой позво-

ляет интенсифицировать массообмен за счет увеличения поверхности кон-

такта фаз и турбулизации жидкости при работе с большими скоростями

подачи газовой и жидкой фаз. В аппарат введены секционные элементы в

виде решеток, оборудованных лопастной насадкой; в центре аппарата на-

ходится труба, через которую вводится воздух, а жидкая фаза поступает

противотоком сверху. Газ, поступая на лопастную насадку, обычно из по-

лиэтилена, вращает ее; это существенно увеличивает поверхность контак-

та газовой и жидкой фаз.

Ферментеры с вводом энергии жидкой фазой (группа ФЖ) наибо-

лее сложны по конструкции и энергоемки, но обеспечивают наиболее вы-

сокие по сравнению с группой ферментеров ГФ значения коэффициента

массопередачи кислорода, свыше 6 кг/м3 ч. В данных аппаратах ввод энер-

гии осуществляется жидкой фазой, обычно самовсасывающими мешалка-

ми или насосами; в последнем варианте жидкость вводится в аппарат че-

рез специальное устройство (сопло, эжектор, диспергатор). Данные аппа-

раты также можно подразделит на ряд типов (рис. 1.7): ферментеры с са-

мовсасывающими мешалками не требуют специальных воздуходувных

машин, так как поступление в них воздуха происходит в результате раз-

режения в воздушной камере мешалки, соединенной с воздуховодом и с

жидкостью, отбрасываемой лопатками мешалки; в эжекционных фермен-

терах возможна рециркуляция газовой фазы, что экономит субстрат, одна-

ко требуется наличие специальных насосов для перекачки газосодержа-

щей культуральной среды. Применение эжекционного ввода газовых суб-

стратов в ферментер может интенсифицировать массообмен на порядок;

струйные ферментеры (с затопленной или падающей струей) оборудуются

мощными насосами, которые забирают культуральную жидкость из ниж-

ней части аппарата и через напорный трубопровод подводят поток к аэри-

рующему устройству (по типу шахтного перепада или напорно-струйные).

Струя жидкости под давлением свободно падает сверху и пронизывает

аэрируемую жидкость до дна аппарата. Происходят интенсивные турбу-

лизация и перемешивание жидкости. Внизу жидкость вновь засасывается

насосом и снова подается вверх аппарата, то есть возникает замкнутый

контур циркуляции. Недостатком данных аппаратов являются потери

энергии при перекачке жидкости, трудности проектирования в связи с

отсутствием надежных методик расчета конструкций и режимов работы

струйных и эжекционных устройств.

Третья группа аппаратов – с подводом энергии газовой и жидкой фа-

зами (группа ФЖГ). Основными их конструкционными элементами яв-

ляются перемешивающие устройства всех известных типов, а также нали-

чие в совокупности насосов и перемешивающих устройств. Это могут

быть аппараты с группой самовсасывающих мешалок и насосом для пере-

качивания культуральной жидкости и другие сочетания перемешивающих

и аэрирующих устройств. Коэффициент массопереноса кислорода в таких

ферментерах может в принципе иметь любые из известных значения.

Перечисленные типы аппаратов возникли в основном в течение «эры»

антибиотиков и белка одноклеточных и применяются, главным образом, в

технической микробиологии.

Прогресс в области получения клеточных и рекомбинантных культур

выдвигает специальные требования к биореакторам. При этом на первый

план выдвигаются такие показатели, как стабильность биологических

агентов, повышенные требования к асептике, лимитация срезовых усло-

вий при перемешивании и др. Однако, многие из таких конструкций пока

еще носят экспериментальный характер.

Продукты. Ассортимент продуктов, получаемых в биотехнологиче-

ских процессах, чрезвычайно широк. По разнообразию и объемам произ-

водства на первом месте стоят продукты, получаемые в процессах, осно-

ванных на жизнедеятельности микроорганизмов. Эти продукты подразде-

ляются на три основные группы:

1 группа – биомасса, которая является целевым продуктом (белок од-

ноклеточных) или используется в качестве биологического агента (био-

метаногенез, бактериальное выщелачивание металлов);

2 группа – первичные метаболиты – это низкомолекулярные соедине-

ния, необходимые для роста микроорганизмов в качестве строительных

блоков макромолекул, коферментов (аминокислоты, витамины, органиче-

ские кислоты);

3 группа – вторичные метаболиты (идиолиты) – это соединения, не

требующиеся для роста микроорганизмов и не связанные с их ростом (ан-

тибиотики, алкалоиды, гормоны роста и токсины).

Среди продуктов микробиологического синтеза – огромное количество

различных биологически активных соединений, в том числе белковых и

лекарственных веществ, ферментов, а также энергоносители (биогаз,

спирты) и минеральные ресурсы (металлы), средства для борьбы с вреди-

телями сельскохозяйственных культур (биоинсектициды) и биоудобрения

(табл. 1.1, 1.2). В связи с развитием новейших методов биотехнологии

(инженерной энзимологии, клеточной и генной инженерии) спектр целе-

вых продуктов непрерывно дополняется. Среди них все большее место

занимают средства диагностики и лечения (гибридомы, моноклональные

антитела, вакцины и сыворотки, гормоны, модифицированные антибиоти-

ки).