И формирования биотехнологии

Вопрос о формировании биотехнологии трактуется неоднозначно: по

мнению одних (Овчинников, Баев, Скрябин), считается правомерным от-

нести к сфере биотехнологии древние процессы брожения, включая полу-

чение спирта, силосование; по мнению других (Аиба, Хемфри, Миллис),

условной датой появления биотехнологии можно считать присуждение

компании «Мерк Кемикал Компани» за достижения в области биохимиче-

ской технологии в 1947 г. премии Мак-Гро – Хилла и, наконец, есть мне-

ние, что начало биотехнологии следует отнести к 70-м годам ХХ столетия

к моменту зарождения генетической инженерии. Видимо, правомерно

отнести возникновение современной биотехнологии, начавшей свое фор-

мирование на базе существующих отраслей микробиологической про-

мышленности, к началу 50-х годов нынешнего века, а весь предшествую-

щий данному периоду этап называть предысторией формирования био-

технологии, ведущей корни из древнейших цивилизаций.

Предысторию формирования биотехнологии можно подразделить на

ряд этапов:

– появление эмпирической технологии в 6-м тысячелетии до н.э.,

– зарождение естественных наук в XV–XVII веках;

– формирование микробиологических производств и начало взаимо-

действия науки и микробиологических производств в конце XIX –

10-х годах XX века, вызвавшее революционное преобразование мик-

робиологических производств;

– создание научно-технических предпосылок для возникновения со-

временной биотехнологии (10-е – конец 40-х годов XX века).

Человек с древнейших времен начал использовать в своей хозяйствен-

ной деятельности биологические организмы, в частности микроорганиз-

мы, не зная об их существовании. Первым микробиологическим процес-

сом, использованным на практике, было брожение – процесс обмена ве-

ществ, при котором в органическом субстрате происходят изменения под

воздействием микробных ферментов. Возбудителями бродильных процес-

сов являются грибы, бактерии, дрожжи. Данные организмы легко культи-

вируются, быстро размножаются в сравнительно простых условиях и син-

тезируют ферменты, вызывающие разложение органических веществ. С

древнейших времен брожение применяли при хлебопечении, пивоварении

и виноделии. Так, при раскопках Вавилона обнаружены дощечки, насчи-

тывающие 6000 лет, с описанием процесса приготовления пива, а в пира-

мидах Египта, построенных в этот же период, – караваи хлеба. Есть све-

дения об очистных сооружениях, которые функционировали в древнем

Риме. С 3–4-го тысячелетий известны человеку процессы пектинового

брожения, лежащие в основе мочки прядильных растений, льна, конопли

и др. С древнейших времен человечество сталкивалось и с отрицательны-

ми последствиями деятельности микроорганизмов (порча продуктов, ин-

фекционные болезни людей и домашнего скота). Следствием этого на пер-

вых этапах были неосознанные, эмпирические попытки разработки методов

и средств борьбы с этими явлениями. Так стали возникать методы консер-

вирования продуктов.

Во второй половине XV века начитается развитие современного есте-

ствознания. На становление и развитие биологии существенное влияние

оказали успехи химии, которая из описательной в этот период превраща-

ется в аналитическую. Произошли сдвиги в изучении сущности процессов

брожения; появился термин «ферментация», а процесс брожения стали

связывать с наличием в среде дрожжей или ферментов. В XVI–XVII веках

сначала во Франции, а затем повсеместно для разрыхления теста стали

использовать пивные дрожжи; позднее с изменением и совершенствова-

нием технологии пивоварения для этих целей стали применять дрожжи

спиртовых производств. В Европе стали добывать медь в процессах бак-

териального выщелачивания.

Во второй половине XVIII века была доказана способность одного ве-

щества разлагать другое. Это послужило началом экспериментального

изучения уникальной способности ферментов к катализу специфических

химических реакций. Таким образом, развитие описательной микробиоло-

гии и изучение химических превращений стали важной предпосылкой для

становления микробиологии и биохимии.

В XIX веке с развитием химических наук были заложены основы орга-

нической химии. В этот период были открыты многие органические ки-

слоты, глицерин, холестерин, глюкоза, первые аминокислоты, осуществ-

лен синтез мочевины. Для зарождения энзимологии большое значение

имело изучение процесса гидролиза полисахаридов. Огромное влияние на

создание научных основ микробиологических производств имели работы

Луи Пастера, который по просьбе правительства Франции исследовал

причины нарушения технологических процессов в ряде производств. Ра-

ботая в области прикладной микробиологии, Пастер сделал ряд крупней-

ших фундаментальных открытий, которые заложили основы современной

технической микробиологии. Пастер неоспоримо доказал, что болезни,

порча продуктов, брожение и гниение вызываются микроорганизмами, и

создал теорию об экзогенности попадания этих организмов в среду. Этим

была доказана несостоятельность бытующей в то время теории самозаро-

ждения микроорганизмов. Работы Пастера заложили научные основы ви-

ноделия, пивоварения, производства спирта и уксуса, борьбы с инфекци-

онными болезнями. Современник Пастера Гексли, оценивая работы Пас-

тера, говорил, что «... он своими открытиями возместил Франции боль-

шую часть контрибуции, уплаченной Германии». Крупным достижением

данного периода была разработка метода чистых культур, а также усо-

вершенствование сред для выделения и выращивания микроорганизмов.

Чистые культуры стали применять в сложившихся микробиологических

производствах. Большое значение имели работы по изучению микробного

антагонизма и применению его в медицине. Мечниковым было создано

учение об антагонизме микробов и научно обоснованы рекомендации для

практических применений этого учения. В этот период активно изучалась

азотфиксация. Немецкие исследователи Гельригель и Вильфарт установи-

ли биологическую природу процесса фиксации азота бобовыми растения-

ми, а Бейеринк выделил чистую культуру клубеньковых бактерий и дока-

зал их присутствие в ризосфере растений. Тогда же блестящими работами

Виноградского, Омельянского, Надсона, Исаченко были заложены основы

геологической микробиологии; начато изучение роли микроорганизмов в

превращениях серы, железа, кальция, грязеобразовании. Стали заклады-

ваться научные основы биологической обработки и обезвреживания сто-

ков. Очистные сооружения, известные со времен Древней Индии и Рим-

ской империи и пришедшие в упадок в средние века, с бурным развитием

промышленности на рубеже XIX–XX веков вновь стали предметом при-

стальных исследований. В этот период начала складываться энзимология.

Для изучения и применения ферментов потребовалась разработка и под-

бор специальных «мягких» методов выделения и очистки. Началось прак-

тическое применение ферментных препаратов для подслащивания ряда

веществ, появились препараты для дубления кож и применения в анали-

тике.

В 70–80-е годы XIX столетия были заложены основы культивирования

растительных клеток и животных тканей. После работ Шванна и Вирхова,

назвавших клетку элементарным организмом, возник интерес к изучению

живых клеток, и начались эксперименты по сохранению жизнеспособно-

сти клеток и кусочков тканей в специфических условиях и средах. В 1865

г. Мендель доложил Обществу испытателей природы свои наблюдения о

закономерностях передачи наследственных признаков.

В начале XX века были введены термины «мутации», «ген», возникла

гипотеза Сэттона-Бовери о том, что хромосомы являются материальными

носителями наследственных признаков. Русский цитолог Навашин рас-

крыл особенности структуры хромосом и заложил основы хромосомной

теории наследственности.

Таким образом, в данный период внедрение научных знаний дало воз-

можность приступить к разработке научно-обоснованных биотехнологий

многих производственных процессов.

Последний период эры предыстории современных биотехнологий (10-

е – 40-е годы XX века) условно можно подразделить на два этапа. На пер-

вом этапе, в начале его, в основном, происходило усовершенствование

технологии существующих производств, а затем, благодаря успехам мик-

робиологии, биохимии и других наук того периода, в результате принци-

пиальных усовершенствований аппаратуры и технологий возникла основа

для организации новых производств. В этот период стали выпускать но-

вые экологически чистые биоудобрения и биологические препараты для

борьбы с вредителями и болезнями сельскохозяйственных растений, воз-

никли производства ряда целевых продуктов (органических растворите-

лей, спиртов), начались промышленные испытания биотехнологических

процессов переработки и использования растительных отходов. Второй

этап данного периода тесно связан с биотехнологическими методами по-

лучения ряда сложных веществ – антибиотиков, ферментов, витаминов______.

Революционным моментом данного периода была промышленная реали-

зация технологии производства антибиотиков. Отправной точкой при

этом послужило открытие Флемингом, Флори и Чейном химиотерапевти-

ческого действия пенициллина. Практически одновременно в СССР Ер-

мольева, изучая действие лизоцима, показала, что он является фактором

естественного иммунитета, а Гаузе и Бражникова получили новый актив-

ный препарат – антибиотик грамицидин.

После второй мировой войны в ходе интенсивного развития промыш-

ленных биотехнологий были организованы производства аминокислот,

белка одноклеточных, превращение стероидов, освоено культивирование

клеток животных и растений. Интактные клетки микроорганизмов широко

стали использовать для получения лекарственных веществ стероидной

природы, были организованы крупные производства вакцин.

Эра новейших биотехнологических процессов, возникшая в течение

последних 25–30 лет, связана с использованием иммобилизованных фер-

ментов и клеточных органелл, а также основана на методах рекомбинант-

ных ДНК. Бурно развивающиеся в настоящее время генетическая и кле-

точная инженерия способствуют тому, что биотехнологии постепенно

завоевывают все новые и новые области производства и решительно вне-

дряются во многие сферы деятельности человека. В 50-е годы после ус-

пешного использования для получения вакцины вируса полиомиелита,

выращиваемого в культуре клеток млекопитающих, линии культур клеток

человека стали незаменимыми для выделения и культивирования ряда

других вирусов, производства антител, интерферона, противоопухолевых

химиопрепаратов. В конце 60-х годов иммобилизованные ферменты и

клетки стали успешно применяться не только для производства полусинте-

тических препаратов, но и для проведения несложных биохимических ана-

лизов.

Возникновение генетической инженерии условно относят к 1972 году,

когда в США Бергом была создана первая рекомбинантная молекула ДНК.

С середины 70-х годов данной проблемой интенсивно занимаются тысячи

научных коллективов и промышленных компаний во всех странах мира.

Сочетание слов «генетика» и «инженерия» свидетельствуют о том, что

наступило время, когда стало возможным конструирование рекомбинант-

ных ДНК и целенаправленно создавать искусственные генетические про-

граммы. Это дало возможность организовать получение многих важных

препаратов, а также начать работу по получению новых суперштаммов-

деградаторов промышленных токсикантов. Внедрение новейших методов

биотехнологии в настоящее время производит переворот в различных об-

ластях биотехнологии, включая биотехнологические процессы. Эти мето-

ды позволяют интенсифицировать экологически чистые биотехнологии

воспроизводства пищи и кормовых препаратов, решать методами задачи

обеспечения человечества материальными и энергетическими ресурсами и

также природоохранные проблемы.

к 16

к 16

к 16

к 16

Передавливание В П

В

рН

рН

Ср

Ср

Ср

Пос

Пос

Пос

Вакуум ПАВ

8 9

4 5 6 7 8

3 13

11 18 20

15 17

Тензодатчик

Отходы на био-

деградацию

Информация

Управление

21 22

САР (ЭВМ)

АСУТП

Установка параметров,

в т.ч. по мат. моделям

Продукты

различной

степени

концентри-

рования и

очистки

23 16

Концен-

траты

Биомассы

(кормовые

и живые),

вакцины

Газообразные продукты

Таким образом, корни биотехнологических процессов уходят в далекое

прошлое, а их будущее необычайно широко и перспективно. Современном

биологическим технологиям под силу создать отрасли, основанные на функ-

ционировании биологических систем, метаболические системы которых об-

ладают уникальными достоинствами и подчинены интересам человечества.

ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ

ПРОИЗВОДСТВ

Важнейшей задачей любого биотехнологического процесса является

разработка и оптимизация научно-обоснованной технологии и аппаратуры

для него. При организации биотехнологических производств частично

был заимствован опыт развитой к тому времени химической технологии.

Однако биотехнологические процессы имеют существенное отличие от

химических в силу того, что в биотехнологии используют более сложную

организацию материи – биологическую. Каждый биологический объект

(клетка, фермент и т. д.) – это автономная саморегулирующаяся система.

Природа биологических процессов сложна и далеко не выяснена оконча-

тельно. Для микробных популяций, например, характерна существенная

гетерогенность по ряду признаков – возраст, физиологическая активность,

устойчивость к воздействию неблагоприятных факторов среды. Они также

подвержены случайным мутациям, частота которых составляет от 10-4 до

10-8. Гетерогенность также может быть обусловлена наличием поверхно-

стей раздела фаз и неоднородностью условий среды.

В общем виде любой биотехнологический процесс включает три основ-

ные стадии: предферментационную, ферментационную и постфермента-

ционную. Принципиальная схема реализации биотехнологических процес-

сов в общем виде может быть представлена блок-схемой, в которой сделана

попытка охватить все варианты ферментационных процессов (рис. 1.1).

Рис. 1.1. Принципиальная схема реализации биотехнологических процессов

(по У. Э. Виестур и др., 1987):

1 – реактор для приготовления сред, 2 – вихревой насос, 3 – аппарат для приготовления твердых сред,

4 – паровая колонка для подогрева сред до температуры стерилизации, 5 – выдерживатель сред при тем-

пературе стерилизации, 6 – теплообменник для охлаждения сред, 7 – мерник – сборник питательной

среды,

8 – дозатор, 9 – анаэробный ферментер, 10 – глубинный аэробный ферментер, 11 – биокаталитический

реактор, 12 – ферментер для поверхностной твердофазной ферментации, 13 – то же для поверхностной

жидкостной ферментации, 14 – экстрактор, 15 – сепаратор для отделения биомассы, 16 – система локаль-

ной автоматики, 17 – плазмолизатор биомассы, 18 – дезинтегратор биомассы, 19 – выпарная установка,

20 – фракционирование дезинтегратов, 21 – сушилка и другие аппараты для обезвоживания, 22 – аппара-

тура для расфасовки продукта, 23 – ионообменные колонны, аппараты для химических и мембранных

методов выделения, центрифуги, фильтры, кристаллизаторы и др. устройства.

Условные обозначения: рН – раствор для коррекции рН, П – компоненты и среды для подпитки,

Пос – посевной материал, В – сжатый воздух, ПАВ – пеногаситель, Ср – стерильная питательная среда,

БА – биологический агент.

На предферментационной стадии осуществляют хранение и подго-

товку культуры продуцента (инокулята), получение и подготовку пита-

тельных субстратов и сред, ферментационной аппаратуры, технологиче-

ской и рециркулируемой воды и воздуха. Поддержание и подготовка чис-

той культуры является очень важным моментом предферментационной

стадии, так как продуцент, его физиолого-биохимические характеристики

и свойства определяют эффективность всего биотехнологического про-

цесса. В отделении чистой культуры осуществляют хранение производст-

венных штаммов и обеспечивают их реактивацию и наработку инокулята

в количествах, требуемых для начала процесса. При выращивании посев-

ных доз инокулята применяют принцип масштабирования, то есть прово-

дят последовательное наращивание биомассы продуцента в колбах, буты-

лях, далее в серии последовательных ферментеров. Каждый последующий

этап данного процесса отличается по объему от предыдущего обычно на

порядок. Полученный инокулят по стерильной посевной линии направля-

ется далее в аппарат, в котором реализуется ферментационная стадия.

Приготовление питательных сред осуществляется в специальных реакто-

рах, оборудованных мешалками. В зависимости от растворимости и со-

вместимости компонентов сред могут быть применены отдельные реакто-

ры. Технология приготовления сред значительно усложняется, если в их

состав входят нерастворимые компоненты. В различных биотехнологиче-

ских процессах применяются различные по происхождению и количест-

вам субстраты, поэтому процесс их приготовления варьирует. Поэтому

дозирование питательных компонентов подбирается и осуществляется

индивидуально на каждом производстве в соответствии с Технологиче-

ским регламентом конкретного процесса. В качестве дозирующего обору-

дования при этом применяются весовые и объемные устройства, исполь-

зуемые в пищевой и химической промышленности. Транспорт веществ

осуществляется насосами, ленточными и шнековыми транспортерами.

Сыпучие компоненты подают в ферментеры с помощью вакуумных насо-

сов. Часто применяют принцип предварительных смесей, то есть соли

предварительно растворяют и затем транспортируют по трубопроводам,

дозируя их подачу по объему. В силу исключительного разнообразия био-

технологических процессов и применяемых для их реализации сред, ме-

тодов и аппаратуры рассмотрение данных элементов далее будет связано с

конкретными биотехнологическими производствами.

Стадия ферментации является основной стадией в биотехнологиче-

ском процессе, так как в ее ходе происходит взаимодействие продуцента с

субстратом и образование целевых продуктов (биомасс, эндо- и экзопро-

дуктов). Эта стадия осуществляется в биохимическом реакторе (фермен-

тере) и может быть организована в зависимости от особенностей исполь-

зуемого продуцента и требований к типу и качеству конечного продукта

различными способами. Ферментация может проходить в строго асепти-

ческих условиях и без соблюдения правил стерильности (так называемая

«незащищенная» ферментация); на жидких и на твердых средах; анаэроб-

но и аэробно. Аэробная ферментация, в свою очередь, может протекать

поверхностно или глубинно (во всей толще питательной среды).

Культивирование биологических объектов может осуществляться в

периодическом и проточном режимах, полунепрерывно с подпиткой

субстратом. При периодическом способе культивирования ферментер

заполняется исходной питательной средой и инокулятом микроорганиз-

мов (Х 0 + S 0 на рис. 1.2). В течение определенного периода времени в ап-

парате происходит взаимодействие микроорганизмов и субстрат сопрово-

ждающееся образованием в культуре продукта (Х + S → P).

Биохимические ______превращения в этом аппарате продолжаются от десят-

ков часов до нескольких суток. Регуляция условий внутри ферментера –

важнейшая задача периодического культивирования микроорганизмов. В

ходе периодической ферментации выращиваемая культура проходит ряд

последовательных стадий: лаг-фазу, экспоненциальную, замедления роста,

стационарную и отмирания. При этом происходят существенные измене-

ния физиологического состояния биообъекта, а также ряда параметров

среды. Целевые продукты образуются в экспоненциальной (первичные

метаболиты – ферменты, аминокислоты, витамины) и стационарной (вто-

ричные метаболиты – антибиотики) фазах, поэтому в зависимости от це-

лей биотехнологического процесса в современных промышленных про-

цессах применяют принцип дифференцированных режимов культивиро-

вания. В результате этого создаются условия для максимальной продук-

ции того или иного целевого продукта. Периодически ферментер опорож-

няют, производят выделение и очистку продукта, и начинается новый

цикл.

Непрерывный процесс культивирования микроорганизмов обладает

существенными преимуществами перед периодическим. Непрерывная

Х S 0 0 +

Рис. 1.2. Схема биореактора периодического действия.

ферментация осуществляется в условиях установившегося режима, когда

микробная популяция и ее продукты наиболее однородны. Применение

непрерывных процессов ферментации создает условия для эффективного

регулирования и управления процессами биосинтеза. Системы непрерыв-

ной ферментации могут быть организованы по принципу полного вытес-

нения или полного смешения. Первый пример – так называемая тубуляр-

ная культура (рис. 1.3).

Процесс ферментации осуществляется в длинной трубе, в которую с

одного конца непрерывно поступают питательные компоненты и иноку-

лят, а с другой с той же скоростью вытекает культуральная жидкость.

Данная система проточной ферментации является гетерогенной.

При непрерывной ферментации в ферментах полного смешения (гомо-

генно-проточный ______способ) во всей массе ферментационного аппарата созда-

ются одинаковые условия. Применение таких систем ферментации позволя-

ет эффективно управлять отдельными стадиями, а также всем биотехноло-

гическим процессом и стабилизировать продуцент в практически любом,

требуемом экспериментатору или биотехнологу состоянии. Управление по-

добными установками осуществляется двумя способами (рис. 1.4).

Х 0

Х S 0 0 + + P

S 0

Рис. 1.3. Схема тубулярного биореактора полного вытеснения.

1 2 1 2

5 6

A Б

Рис. 1.4. Схемы биореакторов для проточного культивирования микроорганизмов.

А – хемостат; Б – турбидостат с автоматической регуляцией оптической плотности.

1 – поступление среды, 2 – мешалка, 3 – сток культуры, 4 – насос, 5 – фотоэлемент, 6 – источник света.

Турбидостатный способ базируется на измерении мутности выходя-

щего потока. Измерение мутности микробной суспензии, вызванное рос-

том клеток, является мерой скорости роста, с которой микроорганизмы

выходят из биореактора. Это позволяет регулировать скорость поступле-

ния в ферментер свежей питательной среды. Второй метод контроля, –

хемостатный, проще. Управление процессом в хемостате осуществляется

измерением не выходящего, а входящего потока. При этом концентрацию

одного из компонентов питательной среды (углерод, кислород, азот), по-

ступающего в ферментер, устанавливают на таком уровне, при котором

другие питательные компоненты находятся в избытке, то есть лимити-

рующая концентрация задающегося биогенного элемента ограничивает

скорость размножения клеток в культуре.

Обеспечение процесса ферментации, с точки зрения инженерной реа-

лизации, сводится к дозированному поступлению в ферментер потоков

(инокулята, воздуха (или газовых смесей), питательных биогенов, пенога-

сителей) и отвода из него тепла, отработанного воздуха, культуральной

жидкости, а также измерению и стабилизации основных параметров про-

цесса на уровне, требуемом для оптимального развития продуцента и об-

разования целевого продукта. В ходе ферментации образуются сложные

смеси, содержащие клетки, внеклеточные метаболиты, остаточные кон-

центрации исходного субстрата. При этом целевые продукты, как прави-

ло, находятся в этой смеси в небольших концентрациях, а многие из них

легко разрушаются. Все это накладывает существенные ограничения на

методы выделения и сушки биологических препаратов.

Постферментационная стадия обеспечивает получение готовой то-

варной продукции и также, что не менее важно, обезвреживание отходов и

побочных продуктов. В зависимости от локализации конечного продукта

(клетка или культуральная жидкость) и его природы на постферментаци-

онной стадии применяют различную аппаратуру и методы выделения и

очистки. Наиболее трудоемко выделение продукта, накапливающегося в

клетках. Первым этапом постферментационной стадии является фракцио-

нирование культуральной жидкости и отделение взвешенной фазы – био-

массы. Наиболее распространенный для этих целей метод – сепарация,

осуществляемая в специальных аппаратах – сепараторах, которые рабо-

тают по различным схемам в зависимости от свойств обрабатываемой

культуральной жидкости. Основные проблемы, возникают при необходи-

мости выделения мелковзвешенных частиц с размером 0.5–1.0 мкм и ме-

нее (бактериальные клетки) и необходимостью переработки больших объ-

емов жидкости (производство кормового белка, ряда аминокислот). Для

повышения эффективности процесса сепарации применяют предваритель-

ную специальную обработку культуры – изменение рН, нагревание, до-

бавление химических агентов. Для увеличения сроков годности биотехно-

логических продуктов производят их обезвоживание и стабилизацию. В

зависимости от свойств продукта применяют различные методы высуши-

вания. Сушка термостабильных препаратов осуществляется на подносах,

ленточном конвейере, а также в кипящем слое. Особо чувствительные к

нагреванию препараты высушивают в вакуум-сушильных шкафах при

пониженном давлении и температуре и в распылительных сушилках. К

стабилизации свойств биотехнологических продуктов ведет добавление в

качестве наполнителей различных веществ. Для стабилизации кормового

белка применяют пшеничные отруби, кукурузную муку, обладающие до-

полнительной питательной ценностью. Для стабилизации ферментных

препаратов используют глицерин и углеводы, которые препятствуют де-

натурации ферментов, а также неорганические ионы кобальта, магния,

натрия, антибиотики и др.

ЭЛЕМЕНТЫ, СЛАГАЮЩИЕ