Бийский технологический институт (филиал)
Е.П. Каменская, Е.В. Аверьянова
КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ УЧЕТ МИКРООРГАНИЗМОВ
Методические рекомендации к лабораторным работам
по курсам «Основы микробиологии», «Микробиология»,
«Общая биология и микробиология» для студентов специальностей 240901 «Биотехнология» и 260204 «Технология бродильных
производств и виноделие» всех форм обучения
Бийск 2007
УДК 543.062:579.23
Каменская, Е.П. Количественный учет микроорганизмов: методические рекомендации к выполнению лабораторных работ по курсам «Основы микробиологии», «Микробиология», «Общая биология и микробиология» для студентов специальностей 240901 «Биотехнология» и 260204 «Технология бродильных производств и виноделие» всех форм обучения / Е.П. Каменская, Е.В. Аверьянова.
Алт. гос. тех. ун-т, БТИ. - Бийск.
Изд-во Алт. гос. тех. ун-та, 2007. - 35 с.
В настоящих методических рекомендациях рассматриваются основные методы определения количества клеток микроорганизмов. Приводятся лабораторные работы по определению общего количества микроорганизмов в сыром молоке, дрожжах. Описаны методы санитарно-бактериологического контроля оборудования, инвентаря и воздуха.
Рассмотрены и утверждены
на заседании кафедры
«Биотехнология».
Протокол № 81 от 16.11.06
Рецензент:
д.б.н., профессор Гайнанова Н.К. (БПГУ им. В.М. Шукшина)
ã Каменская Е.П., Аверьянова Е.В., 2007
ã БТИ АлтГТУ, 2007
ВВЕДЕНИЕ
О росте микроорганизмов в естественных субстратах или в питательных средах судят по изменению количества их клеток или биомассы в единице объема. Методы определения этих показателей могут быть прямыми (подсчет клеток под микроскопом, взвешивание) или косвенными. Косвенные методы основаны на измерении параметров, величина которых зависит от количества или биомассы микроорганизмов (число колоний, выросших после посева суспензии клеток на питательную среду, рассеяние или поглощение суспензией света, содержание в ней белка и т. д.). Выбор метода зависит от целей исследования, свойств питательной среды или субстрата, а также особенностей роста и морфологии микроорганизмов. Так, многие методы, используемые для определения числа одноклеточных микроорганизмов, неприемлемы при подсчете многоклеточных (нитчатых, мицелиальных и других форм).
При оценке численности микроорганизмов, особенно в естественных субстратах (прежде всего в почве), необходимо помнить, что их клетки часто находятся в прикрепленном (адгезированном) состоянии или в виде микроколоний. Поэтому перед началом подсчета их нужно отделить от частиц субстрата и друг от друга (десорбировать). Выбор метода десорбции (механическое перемешивание суспензии клеток, растирание, обработка ультразвуком, применение поверхностно-активных веществ и т. д.) определяется особенностями исследуемого субстрата.
Точность любого метода определения числа микроорганизмов ограничена ошибкой метода, которая возникает вследствие случайного распределения клеток в суспензии и является результатом ограниченного числа подсчитываемых клеток, а также связана с техническими ошибками, т. е. неточностью в приготовлении разведений, неправильным монтажом камеры, повторным учетом одной и той же клетки (колонии) и т. д. Ошибки метода неизбежны, тогда как технические ошибки зависят главным образом от качества работы исследователя. Следует помнить, что статистическая обработка результатов возможна только при минимальной технической ошибке. Чашечный метод и метод предельных разведений требуют особой чистоты и аккуратности при выполнении всех операций. Необходимо тщательно оберегать пипетки, пробирки и среды от заражения микроорганизмами из воздуха, так как каждая случайно попавшая клетка может заметно повысить число микроорганизмов в исследуемом субстрате.
1 ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОК
МИКРООРГАНИЗМОВ ПОД МИКРОСКОПОМ
Для подсчета клеток микроорганизмов под микроскопом можно использовать счетные камеры, препараты фиксированных и окрашенных клеток, приготовленные на предметных стеклах или мембранных фильтрах. Перечисленные методы позволяют определить общее количество клеток в единице объема (как живых, так и мертвых). Основное ограничение большинства указанных методов – необходимость довольно высоких концентраций клеток в единице исследуемого субстрата.
1.1 Подсчет клеток на фиксированных окрашенных мазках
(метод Виноградского – Брида)
Этот метод применяется в различных модификациях для определения численности микроорганизмов в разнообразных естественных субстратах – почве, загрязненной воде, оптически непрозрачных средах, содержащих нерастворимые в воде компоненты, например, крахмал, соевую муку. Преимущество метода заключается также в том, что фиксированные окрашенные препараты могут долго храниться, поэтому подсчет можно производить в удобное для исследователя время.
