Для распознавания объектов методом компьютерной микроскопии необходимо, чтобы составляющие его элементы отличались от фона или от других элементов по яркости, цвету или в текстуре. Основным методом наблюдения и исследования с помощью микроскопа проходящего света является метод светлого поля, который хорош для наблюдения контрастных и окрашенных объектов. Для реализации это метода необходимо иметь:
— собственно микроскоп проходящего света;
— объективы светлого поля (также могут быть использованы специальные объективы — фазовые, поляризационные, безрефлексные, люминесцентные);
— конденсор (также могут быть использованы универсальный конденсор, если в нем есть свободное гнездо светлого поля «СП»/«Н», и поляризационный конденсор);
— осветитель (встроенный).
При необходимости исследовать малоконтрастные объекты, которые невозможно покрасить по тем или иным причинам, используются следующие методы микроскопического контрастирования изображений.
Метод темного поля. Метод основан на эффекте, который достигается освещением объекта полым конусом света, внутренняя апертура которого должна превосходить числовую апертуру применяемого объектива. Таким образом, ни один прямой луч не попадает в объектив.
Рис. 3.2. Изображение, полученное в проходящем свете с помощью метода темного поля
При отсутствии объекта поле будет темным. При наличии — будет наблюдаться яркое блестящее свечение контура вокруг объекта на темном фоне в отраженном или рассеянном (диффузно отраженном) свете (рис. 3.2).
Для создания темного поля в микроскопе проходящего света применяют:
— щелевой метод;
— упрощенный метод, связанный с одновременным диафрагмированием осветительной апертуры конденсора и выходной апертуры объектива, при этом объектив должен иметь ирисовую диафрагму или вкладыш, которые позволяют уменьшать выходное отверстие объектива;
— специальный конденсор темного поля.
При работе с иммерсионными объективами для уменьшения апертуры объектива внутрь него вкладывается специальная диафрагма, имеющаяся обычно в наборе конденсора темного поля.
Если объектив имеет ирисовую диафрагму внутри объектива (кольцо с накаткой и маркировка на корпусе объектива), то, вращая кольцо, можно достичь необходимого перекрытия непрозрачным диском выходного зрачка. При смене объектива конденсор дополнительно настраивают центрировочными винтами, выставляя непрозрачный диск концент- рично относительно выходного зрачка объектива.
Можно получить эффект темного поля с помощью обычного конденсора. Для этого необходимо в плоскость апертурной диафрагмы конденсора (или в откидное гнездо под конденсором) установить пластину с непрозрачным диском. Однако следует помнить, что для каждого объектива этот диск может быть разным из-за величины выходного зрачка объектива. Специальный конденсор фазово-контрастного устройства имеет в одном из гнезд диафрагму темного поля.
Метод применяется для наблюдения живых клеток, микроорганизмов, прозрачных кристаллов и др. элементов, там где достаточно наблюдать контур.
Метод фазового контраста. В отличие от метода темного поля, выявляющего лишь контуры объекта, метод фазового контраста позволяет увидеть элементы внутренней структуры рассматриваемого прозрачного объекта (рис. 3.3). Отличительной особенностью в изображении является наличие галла эффекта по контуру объекта (небольшое просветленное поле вокруг объекта).
Фазово-контрастное устройство дает возможность преобразовывать фазовые изменения световых волн, проходящих через объект в амплитудные. В результате этого прозрачные объекты становятся видимыми.
Рис. 3.3 Изображения, полученные с помощью метода фазового контраста
Метод может быть реализован двумя способами:
— расположение элементов с фазовым и световым кольцами внутри оптических систем объектива и конденсора, соответственно. Этот способ реализуется с помощью фазово-контрастных устройств, которые комплектуются фазовыми объективами и специальным конденсором с набором световых колец (установленных в револьверное устройство конденсора) или обычным конденсором, который комплектуется вкладышем со световым кольцом для одного или нескольких фазовых объективов. В этом случае фазово-контрастное устройство покупается отдельно от микроскопа.
— расположение элементов с фазовым и световым кольцами вне объектива и конденсора, т. е. в вынесенных плоскостях, внутри самого микроскопа. Этот способ реализуется с помощью соответствующих вкладышей, которые устанавливаются в плоскости апертурной диафрагмы конденсора и вынесенной плоскости выходного зрачка объектива. При этом и конденсор, и объектив обычные.
Чаще всего смешанный способ реализуется в инвертированных микроскопах. Фазовые объективы имеют внутри фазовый элемент (линза или пластина) с нанесенным кольцом, которое изменяет фазу и уменьшает амплитуду световой волны. Середина кольца в среднем составляет 1/2...2/3 от выходного зрачка объектива, при этом светопро- пускание кольца составляет 10—30 % в зависимости от типа фазового контраста. Таким образом, фазовое кольцо, нанесенное внутри объектива, выполняет две функции: гасит, как серый светофильтр, сильныйпрямой кольцевой свет из конденсора и придает этому свету постоянное фазовое смещение.
В зависимости от размера фазовых колец и способа их получения, различают:
— положительный фазовый контраст, когда фазовое кольцо в объективе технологически получается путем травления, что вносит «опережение» в прямо прошедший свет, при этом изображение объекта с показателем преломления большим, чем у среды, получается темнее на более светлом фоне (КФ-4, КФ-4М);
— отрицательный фазовый контраст (аноптральный или темнопольный фазовый контраст), когда фазовое кольцо в объективе технологически получается путем нанесения на поверхность стекла тонкой пленки, что вносит «запаздывание» в прямо прошедший свет. При этом изображение объекта с показателем преломления большим, чем у среды, выглядит светлее окружающего темного фона (МФА-2).
VARIEL-контраст (переменный контраст). Для работы с тканями и живыми клетками фирмой «Карл Цейсс» разработан новый метод контрастирования, при котором объект с помощью одного устройства может последовательно наблюдаться в фазовом контрасте, косом освещении и темном поле (рис. 3.4).
При этом в конденсоре применяется диафрагма в форме кольцевого сектора, создающее одностороннее наклонное освещение. В объективе имеется как фазовое кольцо, так и кольцо для VARIEL-контраста. При перемещении диафрагмы конденсора в радиальном направлении извне внутрь устанавливается последовательно одностороннее темноеполе — VARIEL-контраст, как наложение фазового контраста и косого освещения.
Метод применяется в прямом микроскопе Axioskop40 и в инвертированном микроскопе Axiovert40С/200.
Метод поляризации. Поляризованный свет в проходящем свете для биологических объектов применяется, в основном, для волокон, сосудов, кристаллов сахара. Наблюдение производится на всех биологических микроскопах при наличии анализатора и поляризатора, а для цветной картины используется λ-компенсатор (рис. 3.5).
Рис. 3.5. Метод поляризации
Метод люминесценции. Метод основан на наблюдении микроскопических объектов с использованием их способности к свечению. По сравнению с методами обычной микроскопии исследование в свете люминесценции обладает рядом преимуществ: цветное свечение, высокая степень контрастности светящихся объектов на темном фоне, возможность исследования как прозрачных, так и непрозрачных живых объектов, а также различных жизненных процессов в динамике их развития, обнаружения и установления локализации отдельных микробов и вирусов.
В медицинской микробиологии применяют два метода люминесцентной микроскопии: флуорохромирования и флуоресцирующих антител. Флуорохромы — красители, не вызывающие сильной окраски объектов в обычном свете, но флуоресцирующие при облучении ультрафиолетовыми лучами. Из синтетических флюорохромов наилучшие результаты дают акридин оранжевый, корифосфин, примулин, родамин, ФИТЦ (флюоресцеинизотиоцианат), которые обычно применяют в виде слабых водных растворов.
Метод флуорохромирования почти не отличается от общеизвестных методов окрашивания анилиновыми красителями, хотя и требуетменьше времени (доли минуты). В бактериологии этот метод применяется как метод люминесцентного выявления возбудителя туберкулеза, для диагностики таких инфекционных форм, как дифтерия, гонорея, возвратный тиф и др.
Фотолюминесценция представляет собой явление свечения объектов, которое возникает в результате поглощения объектом лучистой энергии. Вследствие некоторых причин, свет люминесценции обладает большей длиной волны, чем поглощенный (правило Стокса). Поэтому люминесценцию выгодно возбуждать либо ультрафиолетовыми лучами (300—400 нм), либо сине-фиолетовыми. В обоих случаях возникает свечение в цветовой гамме всего (или большей части) видимого спектра.
Этот вид люминесценции носит название наведенной (вторичной), в отличие от первичной — собственной флюоресценции, нередко проявляемой витаминами, многими пигментами, некоторыми жировыми веществами и антибиотиками, встречающимися в живых организмах, некоторыми продуктами нормального и патологического обмена.
