История развития микроскопии

Курс лекций по дисциплине

«МИКРОСКОПИЯ»

Составил:

к.ф.-м.н., н.с.,

доцент кафедры ЛБС

Тимченко Е.В.

Самара 2014

СОДЕРЖАНИЕ

ЛЕКЦИЯ №1. 4

ТЕМА 1. ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ МИКРОСКОПИИ. ОСНОВНЫЕ ЧАСТИ МИКРОСКОПА 4

1.1. История развития микроскопии. 4

1.2 Основные части микроскопа. 8

ЛЕКЦИЯ №2. 14

ТЕМА 2.ОСНОВЫ ОПТИЧЕСКОЙ МИКРОСКОПИИ.. 14

2.1. ОСНОВНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ОПТИЧЕСКИХ СИСТЕМ... 14

ЛЕКЦИЯ №3. 22

2.2. Методы контрастирования в микроскопах. 22

. 23

2.2.1 Методы контрастирования в микроскопах проходящего света. 23

2.2.2 Методы контрастирования в микроскопах отраженного света. 28

ЛЕКЦИЯ 4. 32

ТЕМА 3. ТИПЫ ОПТИЧЕСКИХ МИКРОСКОПОВ.. 32

3.1 Оптический микроскоп проходящего света. 32

3.2. Оптический микроскоп отраженного света. 32

3.3 Флуоресцентный микроскоп. 34

3.4. Интерференционная микроскопия. 36

3.5 Поляризационный микроскоп. 37

ЛЕКЦИЯ 5. 39

ТЕМА 4. ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ.. 39

Существующие виды электронных микроскопов: 40

4.1 ПРОСВЕЧИВАЮЩАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ. 41

4.1.1. ОСНОВЫ ПРОСВЕЧИВАЮЩЕЙ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ.. 41

4.1.2 КОНСТРУКЦИЯ ПРОСВЕЧИВАЮЩЕГО ЭЛЕКТРОННОГО МИКРОСКОПА.. 41

4.1.3. ПОДГОТОВКА ОБЪЕКТОВ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОСОБЫЕ ТРЕБОВАНИЯ К НИМ 44

4.1.4. ФОРМИРОВАНИЕ ЛУЧА.. 44

4.1.5. НЕДОСТАТКИ И ОГРАНИЧЕНИЯ, ОСОБЕННОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ПЭМ... 45

ЛЕКЦИЯ №6-7. 48

4.2. РАСТРОВАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ. ФИЗИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ РАСТРОВОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ.. 48

4.2.1. ФИЗИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ РАСТРОВОЙ МИКРОСКОПИИ.. 48

4.2.2. УСТРОЙСТВО И РАБОТА РАСТРОВОГО ЭЛЕКТРОННОГО МИКРОСКОПА.. 51

4.2.3 ПОДГОТОВКА ОБЪЕКТОВ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОСОБЫЕ ТРЕБОВАНИЯ К НИМ 57

4.2.4 ТЕХНИЧЕСКИЕ ВОЗМОЖНОСТИ РАСТРОВОГО ЭЛЕКТРОННОГО МИКРОСКОПА 57

ЛЕКЦИЯ №8. 59

4.3. ЗЕРКАЛЬНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ. 59

4.3.1. ФИЗИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЗЕРКАЛЬНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ.. 59

4.3.2 КОНСТРУКЦИЯ ЗЕРКАЛЬНОГО ЭЛЕКТРОННОГО МИКРОСКОПА.. 61

4.3.3. ВИДЫ ОТОБРАЖЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ.. 64

4.3.4. ПРИМЕНЕНИЕ ЗЭМ... 66

ЛЕКЦИИ №9-10. 68

ТЕМА 5. КОНФОКАЛЬНАЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ.. 68

5.1 Принципы конфокальной микроскопии. 68

Основные характеристики лазерного конфокального микроскопа будут изучены на лабораторных работах. 72

5.2. Применения конфокальной микроскопии в биологии. Изучение структуры объекта. 72

5.3 Мультиспектральные исследования. Колокализация. 73

5.4. Динамические процессы.. 75

5.5 FRAP. 75

5.6 FRET. 78

5.7 Новейшие разработки ЛСКМ. Мультифотонная микроскопия. 79

5.8. 4-пи конфокальная микроскопия. 81

5.9 STED микроскопия. 83

5.10 Перспективы развития ЛСКМ... 84

ЛЕКЦИЯ № 11. 85

ТЕМА 6. РЕНТГЕНОСПЕКТРАЛЬНЫЙ МИКРОАНАЛИЗ. 85

6.1. ФИЗИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ РЕНТГЕНОСПЕКТРАЛЬНОГО МИКРОАНАЛИЗА.. 85

6.2. УСТРОЙСТВО И РАБОТА РЕНТГЕНОСПЕКТРАЛЬНОГО МИКРОАНАЛИЗАТОРА 87

6.3. ПОДГОТОВКА ОБЪЕКТОВ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОСОБЫЕ ТРЕБОВАНИЯ К НИМ 88

6.4. ТЕХНИЧЕСКИЕ ВОЗМОЖНОСТИ РЕНТГЕНОСПЕКТРАЛЬНОГО МИКРОАНАЛИЗАТОРА 89

6.5. ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ РЕНТГЕНОСПЕКТРАЛЬНОГО МИКРОАНАЛИЗАТОРА 90

ЛЕКЦИИ №12. 92

ТЕМА 7. ОСНОВЫ СКАНИРУЮЩЕЙ АТОМНО-СИЛОВОЙ И ТУННЕЛЬНОЙ МИКРОСКОПИИ 92

7.1 Принцип работы атомно-силового микроскопа. 92

7.2. Техника измерений атомно-силовой микроскопии. 94

ЛЕКЦИЯ №1

ТЕМА 1. ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ МИКРОСКОПИИ. ОСНОВНЫЕ ЧАСТИ МИКРОСКОПА

История развития микроскопии

Увеличительные стекла изготавливались в Пизе (Италия) уже в конце тринадцатого столетия, изобретение очков приписывают Роджеру Бэкону, францисканскому монаху и преподавателю Оксфордского университета XIII века. Любопытно, что в то время никто не пытался поместить одну линзу перед другой с целью создания телескопа или микроскопа.

Каково различие между оптическим телескопом и микроскопом? В телескопе реальное изображение, созданное объективом (с большим фокусным расстоянием f₀), формируется в задней фокальной плоскости. Окуляр телескопа размещают так, чтобы это изображение оказалось в его передней фокальной плоскости, как показано на рис. 1.1. В отличие от телескопа, объектив микроскопа имеет очень короткое фокусное расстояние. Рассматриваемый объект помещают очень близко к фокусу объектива, чтобы расстояние до изображения было намного больше фокусного расстояния. Промежуточное изображение объекта является реальным и увеличенным. Его рассматривают через окуляр, который повторно увеличивает изображение, как показано на рис. 1.2.

Рис. 1.1Из двух собирающих линз можно сделать телескоп. Параллельные лучи от звезд сходятся в фокусной плоскости объектива, совпадающей с передней фокусной плоскостью окуляра. Увеличение такой системы равно

М=Ɵ_е/Ɵ_о= -ƒ_о/ƒ_е,

где ƒ_о и ƒ_е — фокусные расстояния объектива и окуляра. В телескопе объектив является длиннофокусным, а окуляр — короткофокусным. Окуляр действует подобно простой лупе, в которую рассматривают реальное изображение, формируемое объективом.

Есть соблазн увеличивать изображение объекта до бесконечности, добавляя дополнительные линзы. Однако французский ученый Аббе^{^[1]} показал, что из-за волнового характера света невозможно различить особенности, расстояние между которыми меньше длины волны. Поэтому использование слишком большого количества линз ведет к бесполезному увеличению.

Телескопы имеют большой диаметр, поскольку они должны собирать достаточное количество света от удаленных неярких звезд. Микроскоп же должен иметь максимальное разрешение. В оптическом микроскопе яркость изображения достигается за счет использования интенсивного источника света. Отраженный (или прошедший) свет собирают при помощи объектива с большим значением числовой апертуры NA, характеризующей долю собираемого света.

Изобретение микроскопа приписывают голландскому драпировщику Энтони ван Левенгуку, жившему в XVII веке. Левенгук создал простейший микроскоп, состоящий из двух крошечных линз-бусинок в металлической оправе, которую подносили к глазу. Умение и терпение Левенгука были таковы, что разрешающая способность его микроскопа была значительно выше, чем у большинства более сложных микроскопов, построенных в XVIII столетии! Изобретение телескопа приписывают Галилею (в 1610 году).

Рис. 1.2.Простейший микроскоп состоит из двух собирающих линз. Короткофокусный объектив с фокусным расстоянием f₀создает реальное изображение на небольшом расстоянии Lот фокусной плоскости. Это изображение рассматривают через окуляр с фокусным расстоянием f_e, причем конечное изображение находится на расстоянии наилучшего видения l_n от глаза. Увеличение микроскопа равно

Уже первые микроскопы, появившиеся в XVII веке, поразили воображение ученых того времени. В 1660 году Марчелло Мальпиги использовал микроскоп для подтверждения теории Вильяма Харви о циркуляции крови, рассматривая поток крови в кровеносных капиллярах лягушки. После этого в течение следующих 200 лет практически все микроскопы имели специальные пластинки, позволявшие наблюдать циркуляцию крови рыб и лягушек. Вопросы, занимавшие микроскопистов XVII века, описаны в трактате «Micrographia» Роберта Гука, изданном в 1651 году. Важнейшими техническими проблемами микроскопов того времени были хроматическая и сферическая аберрации объективов, а также недостаточная жесткость корпуса и тубуса.

Объектив микроскопа фокусируют на образец, полученное промежуточное изображение рассматривают в окуляр и получают увеличенное реальное изображение (рис. 1.2). Поскольку яркость изображения обратно пропорциональна квадрату числовой апертуры, она обратно пропорциональна квадрату увеличения. Отметим, что во флуоресцентном микроскопе отраженного света яркость обратно пропорциональна четвертой степени числовой апертуры.

Увеличение микроскопа равно произведению поперечного увеличения объектива и углового увеличения окуляра:

M=˗Ll_n/f₀f_e

где — длина тубуса микроскопа (равная расстоянию между задним фокусом объектива и передним фокусом окуляра), - расстояние наилучшего видения, и — фокусные расстояния объектива и окуляра соответственно.

Если между линзой и образцом находится воздух, максимальное значение величины пsinа равно единице, но на практике числовая апертура NAредко превышает 0,85^{^[2]}. В микроскопии часто используют иммерсионные объективы, погружаемые в жидкость^{^[3]} (рис. 1.3). Поскольку показатель преломления масла или другой иммерсионной жидкости (и покровного стекла) выше, чем у воздуха, это позволяет увеличить максимальный угол, под которым лучи от точечного источника попадают в объектив. Следовательно, при использовании иммерсии значение NAвыше, чем в случае воздуха. Максимальные значения NAиммерсионных объективов достигают 1,3—1,4 в зависимости от типа иммерсионной жидкости. Обратим внимание, что объектив, предназначенный для работы с определенным типом иммерсии, с другим применять не следует. Объективы микроскопов проходящего света в основном предназначены для работы с покровным стеклом, а объективы микроскопов отраженного света работают без них, и это нужно учитывать при работе.

Яркость изображения определяется количеством попадающего в объектив света, которое пропорционально величине NA. Если объектив сфокусирован на определенную плоскость, то особенности объекта, находящиеся в пространстве немного выше и ниже этой плоскости, оказываются не в фокусе. Диапазон расстояния, на котором особенности объекта выглядят достаточно резко, называют глубиной резкости. Таким образом, плоскость объекта можно считать тонким слоем, в котором все точки находятся в фокусе. Глубина резкости hвыражается формулой:

где п — показатель преломления изучаемого материала.

Рис. 1. 3. Чтобы не повредить образец, его накрывают покровным стеклом. В этом случае из-за преломления света на границе со стеклом максимальный угол, под которым свет точечного источника попадает в объектив, меньше, чем без покровного стекла (а). Если использовать иммерсионный объектив и согласовать показатель преломления масла с показателем преломления стекла, апертура выше (b).

Поле зрения, т.е. та часть поверхности образца, которая видна в микроскопе, зависит как от объектива, так и от окуляра^{^[4]}. Размер изображения может быть ограничен внутренним диаметром тубуса микроскопа (стандартный размер которого равен 23,2 мм)^{^[5]}, но на практике он обычно ограничивается диаметром окуляра (18 мм)^{^[6]}. Таким образом, при десятикратном (10х) увеличении окуляра и увеличении объектива 10х диаметр поля зрения равен 1,8 мм. Если увеличение микроскопа равно 40х, диаметр поля зрения равен 0,45 мм. Отметим, что выпускаются широкопольные микроскопы с диаметром тубуса 30 мм^{^[7]}, плоскими объективами и широкопольными окулярами. Такие микроскопы особенно удобны для фотографирования.

Один из наиболее важных вопросов состоит в том, при каком увеличении микроскопист может увидеть все детали объекта? Ответ на него зависит от разрешающей способности глаза. Невооруженный глаз может различить две точки, если угол между ними не меньше одной минуты. Таким образом, на расстоянии наилучшего видения разрешающая способность глаза равна 100 мкм. Чтобы избежать излишнего напряжения глаза, расстояние между двумя точками должно быть в два-три раза больше. Минимальное увеличение, необходимое для разрешения двух точек, равно отношению разрешающей способности глаза (скажем, 300 мкм) к расстоянию между этими точками. Расстояние между двумя точками ограничено длиной волны, и это означает, что оптимальное увеличение находится в интервале от 500х до 1000х. Если используется большее увеличение, снижается количество разрешаемых деталей, а качество изображения ухудшается, поскольку становится заметной дифракционная размытость^{^[8]}. Избыточное увеличение называют бесполезным.

Основные части микроскопа

Функциональные и конструктивно-технологические части микроскопа предназначены для обеспечения работы микроскопам получения устойчивого, максимально точного, увеличенного изображения объекта.

Световой микроскоп включает в себя две части; механическую и оптическую. Последняя включает в себя три основных функциональных блока; визуализирующая часть, воспроизводящая часть, осветительная часть (рис. 3).

Рис. 3 – Структурная схема микроскопа

Механическая часть микроскопа. Основным конструктивно-механическим блоком микроскопа являются штатив, который включает в себя следующие основные части; основание иту6усодержатель(рис. 4),

Основание представляет собой блок, на котором крепится весь микроскоп. Впростых микроскопах на основание устанавливают осветительные зеркала или накладные осветители. В более сложных моделях осветительная система встроена в основание с блоком питания или без него.

Тубусодержатель представляет собой блок, на котором закрепляются;

— узел крепления светоделительных элементов (блоков для отраженного света; блоков светофильтров люминесцентного осветителя);

— узел смены объективов (револьверное устройство);

— фокусировочный механизм грубой и точной настройки микроскопа на резкость;

- узел крепления сменных предметных столиков;

— узел крепления, а также фокусироночного и центрировочного перемещения конденсора;

— узел крепления сменных насадок (визуальных, фотографических, телевизионных, различных передающих устройств).

Рис. 4. Структурная схема механической части микроскопа

Одним из основных и точных элементов, входящих в механическую часть микроскопа, является предметный столик, предназначенный для крепления препарата и фиксации его в определенном положении под микроскопом. Столики бывают неподвижные, координатные, поворотные (на ограниченный угол) и вращающиеся (центрируемые и нецентрируемые).

На стол устанавливаются препаратодержатели и препаратоводители. Последние практически не применяются в современных микроскопах, кроме поляризационных микроскопов.

Осветительная часть предназначена для создания равномерного светового потока, который проходит через объект (проходящий свет) или отражается от него (отраженный и падающий свет), а также для обеспечения условий точного воспроизведения объекта по цвету, форме и разрешению элементов в конечном увеличенном изображении. Осветительная часть включает:

- источник света (лампа и электрический блок питания);

-оптико-механическую систему, расположенную за лампой.

Для микроскопов проходящего света оптико-механическая часть состоит из коллектора, полевой ирисовой диаграммы, и конденсора совстроенной апертурной ирисовой диафрагмой. В микроскопах отраженного света роль конденсора играет объектив, кроме того, в осветительную систему входит полупрозрачное зеркало, отражающий осветительный поток от источника света на объект и пропускающий световой поток, формирующий изображение.

Габаритный размер и увеличение осветительной системы (оптики коллекторной части и конденсора) связаны с формой и размером нити лампы. Кучитываемым геометрическим параметрам ламп, применяемых в микроскопах, относятся высота светового центра (точка, относительно которой строится светораспределение лампы) и размер источника света (длина светящейся части, диаметр спирали, площадь, заполненная светящейся частью).

Это же можно сказать и собственно об источнике, мощность и габаритные размеры которого влияют на параметры и габаритные размеры блока питания лампы. При этом следует отметить, что все это влияет на габариты и дизайн самого микроскопа.

Равномерность освещенности и яркость в поле зрения микроскопа (в плоскости изображения) определяется равномерностью освещения объекта в плоскости предмета и равномерностью и полнотой заполнения плоскости выходного зрачка объектива изображением нити лампы (источника свега).

В современных микроскопах отечественного и зарубежного производства применяются встроенные воснование микроскопа осветительные системы с галогенными, ксеноновыми или ртутными лампами. Мощность галогенных ламп 6 В 20 Вт, 12 В 30—40 Вт. В исследовательских и универсальных моделях лампы уже более мощные —12 В100 Вт. Основными критериями для выбора ламп обычно являются: 1) световой поток, излучаемый лампой при ее включении на номинальное напряжение; 2) максимальная сила света или яркость тела накала; 3) стабильность светового потока лампы; 4) цветовая температура лампы; 5) пропускаемое оптическое излучение.

Для выравнивания света обычно применяются светофильтры. Обычно в микроскопах, начиная с лабораторных моделей (например, серии Axioskop 40), устанавливается система нейтральных фильтров с различными коэффициентами светопропускания. Это особенно важно, т. к. тенденция развития исследовательских моделей, да и лабораторных тоже, связана с моторизованной настройкой — полуавтоматическими и автоматическими регулировками.

Коллектор. При встроенной осветительной системе проходящего света коллекторная часть линзы расположена вблизи источника света в основании микроскопа и предназначена для увеличения размера светящегося тела (лампы). Для обеспечения настройки осветительной системы коллектор может быть выполнен подвижным, что обеспечивает его перемещение вдольоптической оси. Вблизи коллектора располагается полевая диафрагма микроскопа.

Конденсор. Оптическая система конденсора предназначена для увеличения количества света, поступающего от осветителя на объект. В его состав входит несколько линз, основное назначение которых превратить параллельные лучи идущие от осветителя в сходящиеся. По сути, конденсор представляет собой светосильный короткофокусный объектив, который должен иметь апертуру равную апертуре объектива.

Конденсор располагается между объектом (предметным столиком) и осветителем (источником света). В учебных и простых микроскопах конденсор может быть выполнен несъемным и неподвижным. В остальных случаях конденсор является съемной частью и при настройке освещения имеет фокусировочное перемещение вдоль оптической оси и центрировочное перемещение, перпендикулярное оптической оси. При конденсоре всегда находится осветительная апертурная диафрагма, необходимая для правильного освещения препарата. Важным является аберрационный расчет конденсора, его ахроматизация. От аберрационного качества конденсора зависит световой фон в плоскости предмета.

В микроскопах отраженного света проблема качества конденсора решена просто, за счет аберрационного качества объектива.

Воспроизводящая часть предназначена для создания увеличенного изображения объекта в промежуточной плоскости — плоскости изображения. Эта часть микроскопа, с учетом возможности используемой оптики, обеспечивает построение изображения, которое повторяет объект, увеличивая егос соответствующим разрешением, контрастом и цветопередачей. Воспроизводящая часть обеспечивает первую ступень увеличения.

Воспроизводящая часть включает объектив и промежуточную оптическую систему. Современные микроскопы последнего поколения базируются на оптических системах объективов, скорректированных на «бесконечность». В отличие от микроскопов предыдущего поколения с конечной длиной тубуса 160 мм, современные имеют дополнительную линзовую систему, называемую «тубусной», которая параллельные пучки света, выходящие из объектива, «собирает» в плоскости изображения микроскопа и обеспечивает таким образом само изображение.

Объективы микроскопа предназначены для построения действительного микроскопического изображения с соответствующим увеличением, разрешением элементов, точностью воспроизведения по форме и цвету объекта исследования.

Объектив состоит из фронтальной и последующей частей. Фронтальная линза (или система линз) обращена к препарату и является основной при построении изображения соответствующего качества, определяет рабочее расстояние и числовую апертуру объектива. Последующая часть в сочетании с фронтальной обеспечивает требуемое увеличение, фокусное расстояние и качество изображения, а также определяет конструкцию объектива и микроскопа в целом (высоту объектива и длину тубуса микроскопа).

Визуализирующая часть предназначена для получения реального изображения объекта на сетчатке глаза, на фотопленке или пластинке, на матрице камеры.

Визуализирующая часть включает следующие элементы:

• визуальная насадка (монокулярная, бинокулярная или бинокулярная с фото-видеовыходом);

• окуляры для наблюдения;

• система дополнительного увеличения (система «Оптовар»);

• проекционные насадки, в том числе дискуссионные для двух и более наблюдателей;

• рисовальные аппараты;

• адаптерные (согласующие) элементы систем анализа и документирования изображения, имеющие дополнительное увеличение.

Микроскоп отраженного света (например, люминесцентный) имеет аналогичные воспроизводящую и визуализирующую части, однако, осветительная система отличается. В качестве конденсора выступает объектив.

ЛЕКЦИЯ №2