К основным параметрам микроскопа относятся:
1) увеличение;
2) числовая апертура
3) разрешающая способность;
4) глубина резкости;
5) степень аберраций.
Весогабаритные параметры обычно определяются классом сложности микроскопа.
Для описания основных процессов, происходящих, при формировании изображения в микроскопе, удобно воспользоваться классической схемой оптического микроскопа. На рис. 2.1 показана схема простейшего трехлинзового прибора, работающего на просвет. Для освещения объекта должен быть сформирован определенным образом световой поток (параллельный или сходящийся пучок). Эта задача решается при помощи апертурной диафрагмы, вырезающей необходимую часть светового пучка источника света, и специальной линзой (в более общем случае системы линз), называемой конденсорной линзой или просто конденсором. Апертурная диафрагма, ограничивающая световой поток, называется апертурной диафрагмой конденсора. Сформированный таким образом световой пучок проходит далее еще через одну диафрагму, ограничивающую освещаемое поле объекта. Поэтому эта диафрагма называется полевой. Наблюдаемый объект рассеивает свет, который далее попадает в объективную линзу (в более общем случае систему линз, называемую объективом), в плоскости изображения которой формируется первое увеличенное изображение объекта. Это изображение может затем наблюдаться при помощи окулярной линзы или проектироваться на экран проекционной линзой. Качество изображения определяется главным образом параметрами объективной линзы.
Рассмотрим основные характеристики, которыми должна обладать объективная линза. Основной функцией объективной линзы является создание действительного увеличенного изображения образца в плоскости объекта окулярной или проекционной линзами. Увеличение объективной линзы определяется отношением размера промежуточного изображения, которое она формирует, к истинному размеру объекта. Увеличение объективных линз оптических микроскопов может составлять от нескольких единиц до сотни.
1) Полное увеличение такой системы определяется выражением
(2.1)
Здесь f1, f2 - фокусные расстояния объективной и окулярной линз, Δ -
расстояние между фокусами этих линз, D - расстояние наилучшего зрения.
Например, если для типичного случая f1=2mm, f2=15mm, Δ =1,0mm,
D=250mm, коэффициент увеличения такого микроскопа K=1335.
Рис. 2.1. Оптическая схема трехлинзового оптического микроскопа. 1-источник света, 2-апертурная диафрагма конденсора, 3-конденсорная линза, 4-полевая диафрагма, 5- объект, 6-объективная линза, 7-первое увеличенное действительное изображение, 8- окулярная линза, 9-второе увеличенное мнимое изображение.
Увеличение – этокажущаяся величина предмета определяется его изображением на сетчатке.
В случае невооруженного глаза кажущийся размер зависит от угла, под которым предмет виден. Для нормального глаза наименьшее расстояние отчетливого зрения примерно равно 250 мм. Это расстояние
наиболее удобно для рассматривания деталей предмета. Увеличение служит для того, чтобы расширить (развернуть) микроскопическое изображение на известный угол зрения, позволяющий глазу яснее различать детали.
Общее увеличение микроскопа [9]зависит от увеличения объектива, окуляра, промежуточных увеличивающих систем (дополнительной системы увеличений «Оптовар», фото/видео адаптера). Общее увеличение микроскопа равно произведению значений увеличений всех оптических систем:
где 
- общее увеличение микроскопа, 
- увеличение объектива, 
- увеличение окуляра, 
, 
- увеличение дополнительных систем.
Полезное увеличение микроскопа должно быть не более 1000 числовых апертур объектива и не менее 500.
500 АОБ< Гм< 1000 АОБ, где АОБ — числовая апертура объектива.
Более высокое увеличение или меньше меньшего не выявляет новых деталей объекта в изображении. Например, для объектива 100х с числовой апертурой) 1,25 полезное увеличение микроскопа лежит в диапазоне 625—1250х. При большем увеличении изображение становится нечетким и малоконтрастным, с пониженной разрешающей способностью. При меньшем увеличении изображение объекта, несмотря на четкость и повышенный контраст, становится настолько мелким, что элементы объекта практически неразличимы.
В повседневной практике обычно используют увеличение порядка 630— 1000х.
Увеличение объектива. При конечной длине тубуса (например, 160 мм) увеличение объектива является исходным и определяется следующим образом:
где Д.Т. - механическая длина тубуса, 
- фокусное расстояние объектива.
Основным для расчета увеличения объектива скорретированного на «бесконечность» является фокусное расстояние тубусной линзы или системы и фокусное расстояние самого объектива;
где 
— фокусное расстояние тубусной линзы.
Например, если объектив имеет фокусное расстояние 1,6 мм, а числовую апертуру 1,25, то при работе с тубусной системой, имеющей величину фокусного расстояния 160 мм, увеличение микроскопа будет 100/. В го время как при тубусной системе 250 мм (как было ранее принято в микроскопах отраженного света) увеличение этого же объектива будет составлять 156>г При этом входная числовая апертура остается прежней, а вот выходная изменяется. В первом случае это будет 0,0125, во втором - 0,008.
Увеличение окуляра и видеоадаптеров определяется по формуле лупы:
где 250— расстояние наилучшего видения в мм, 
— фокусное расстояние окуляра.
2) Объектив может собрать лишь часть света, рассеиваемого образцом, ограниченную конусом, образованным диаметром линзы и расстоянием между плоскостью линзы и образцом. Эта особенность линзы называется числовой апертурой линзы и характеризует способность линзы собирать световые пучки. Числовая апертура определяется формулой
A =n ∙ sinβ,(4.2.)
где n - показатель преломления среды, располагаемой между поверхностью объективной линзы и объектом, β- половина апертурного угла при вершине конуса светового потока, собираемого линзой.
Числовая апертура определяет ряд важнейших свойств микроскопа: яркость изображения, «проникающую» способность (глубину резкого видения) и «отображающую» способность, т. е. степень сходства изображения с предметом (разрешающая способность). Увеличение числовой апертуры повышает способность объектива воспроизводить мелкие детали объекта.
Кроме этого, числовая апертура «управляет» условиями наблюдения: освещенностью в плоскости предмета (принцип Келера) и полезным увеличением.
Для увеличения апертуры объектива между фронтальной линзой объектива и препаратом помешают среду, имеющую более высокий показатель преломления, чем воздух (воду, глицерин или масляную иммерсию). Объективы проходящего света (до 63х) и отраженного света (до 200х), работающие в воздухе, называются «сухими системами» и значение их числовой апертуры не превышает 0,95. Иммерсионные объективы имеют числовую апертуру до 1,45.
Числовая апертура объективов всегда маркируется на корпусе. Например, надпись «40х/0.95» означает, что это объектив с увеличением 40* и числовой апертурой 0,95.
3) Одной из наиболее важных характеристик объектива является разрешающая способность линзы, т.е. свойство линзы разрешать близко расположенные детали образца. Иными словами, разрешающая способность объективной линзы - это наименьшее расстояние между двумя точками объекта, при котором эти точки на изображении разрешаются как две отдельные точки. Предельная разрешающая способность линзы определяется дифракционными свойствами линзы и может быть записана в виде
(4.3)
где λ - длина волны света, используемого для освещения объекта, а A - числовая апертура объективной линзы.
Разрешающая способность микроскопа - эго способность глаза или оптического прибора различать мелкие детали, т. е. наименьшее расстояние между изображениями двух соседних точек (линий), которые различаются как два отдельных изображения. Для нормального глаза предельное угловое разрешение составляет около 1", что соответствует 0,0045 мм на сетчатке. Разрешающая способность является одним из наиболее важных параметров микроскопа, определяющих качество получаемого изображения. Она зависит от числовых апертур объектива и конденсора, а также длины волны света.
Волновые свойства света определяют предел разрешения в оптических приборах. По дифракционной теории образования изображения в световом микроскопе Аббе нельзя видеть объекты меньше полудлины волны и нельзя получить изображение меньше полудлины волны;
где d — разрешающая способность микроскопа, мкм; λ0— длина волны, мкм; AОБ— числовая апертура объектива.
Из этой формулы, очевидно, что при освещении объекта одной длиной волны разрешающая способность микроскопа возрастает с увеличением апертуры объектива. Например, при наблюдении в видимом свете разрешающая способность объектива с числовой апертурой 0,50 равна 0,55 мкм, для апертуры 1,4—0,19 мкм, в то время как малая апертура 0,25 позволяет разрешить объекты размером не более 1,1 мкм.
Широко известна формула Аббе:
где: AОБ - числовая апертура объектива, Аосв - числовая апертура конденсора.
Именно при равенстве числовых апертур гарантировано условие б>0,5Хл/АО6 (рис. 2.2).
Рис. 2.2. УсловиеАббе: равенство числовыхапертур конденсораи объектива
Для малоконтрастных объектов известно еще одно правило: если апертурная диафрагма конденсора прикрыта на 1/3 числовой апертуры, то достигается наилучшее контрастирование объекта без потери разрешения в микроскопе. В таком случае правомочной становится формула:
4) Другой характеристикой линзы является глубина резкости.
Она характеризует величину смещения образца вдоль оптической оси, которое может быть произведено без заметного ухудшения фокусировки изображения. Глубина резкости обратно пропорциональна квадрату числовой апертуры т.е. 1 / A2, а это означает, что при значительных неровностях поверхности образца целесообразно использовать объективы с малой числовой апертурой.
5)Наряду с дифракционными ограничениями разрешающую способность линз ухудшают различного рода дефекты, называемые в оптике аберрациями. Наиболее распространенными считаются пять типов аберраций: сферическая и хроматическая аберрации, астигматизм, кома, и дисторсия. На рис. 2.3 схематически показано, как образуются эти типы ошибок в передаче изображений линзами.
Рис. 2.3. Аберрации линз. а)-сферическая аберрация, б)-кома, в)-хроматическая аберрация, г)-астигматизм, д)-дисторсия.
Сферическая аберрация обусловлена тем, что лучи, проходящие через участки линзы, расположенные на различных расстояниях от оптической оси, фокусируются на различных расстояниях от центра линзы, т.е. имеют слегка отличные фокусные расстояния. Поэтому фокус линзы будет размыт вдоль оптической оси. Это главный дефект объективных линз, в особенности в электронной микроскопии. Если рассматривать изображения точек образца, располагающихся на некотором расстоянии от оптической оси линзы, то изображения их будут размытыми даже в случае полной компенсации сферической аберрации. Такие искажения получили название кома.
Хроматическая аберрация возникает в случае освещения объекта немонохроматическим светом. Световые лучи более короткой длины волны преломляются меньше, чем лучи более длинноволновые, отсюда возникает цветовое размытие фокуса вдоль оптической оси.
Хроматическая аберрация, обусловленная зависимостью показателей преломления оптическихсред оптической системы отдлины световой волны, связаны стем, что оптическая система, преломляя лучи света, разлагает белый свет на составные части. При этом образуются в каждом цвете отдельные изображения, расположенные на различных расстояниях от системы.
Хроматическая аберрация положения связана с тем, что лучи различных длин волн пересекаются в разных местах вдоль оптической оси. В соответствии с этим будет происходить наложение друг на друга изображений, которые различаются по цвету и по-разному сфокусированы. Этовыражается втом, что изображение объекта имеет вид «слоеного пирога», когда разноцветные изображения накладываются друг на друга.
Хроматическая аберрация увеличения связана с тем, что изображения, образованные лучами разных длин волн, имеют разную величину, но расположены в одной плоскости фокусировки. Это выражается втом, что изображение объекта имеет разноцветную окантовку.
|
|
Рис. 2.4.Хроматическая аберрация увеличения
Более сложным видом искажений является астигматизм.
Он обусловлен нарушением осевой симметрии линзы и приводит к отличию фокусных расстояний для лучей, проходящих в плоскости рисунка, и лучей, располагающихся в перпендикулярной плоскости. Искажения этого типа особенно существенны для электронной микроскопии, т. к. изготовить магнитную линзу (диаметры полюсных сердечников такой линзы могут составлять 10см. и более) с высокой степенью осевой симметрии достаточно сложно.
И, наконец, аберрация, называемая дисторсией, возникает, когда отдельные точки объекта, располагающиеся на разных расстояниях от оптической оси, имеют разное увеличение. В случае, когда увеличение уменьшается с увеличением расстояния от оптической оси, дисторсия называется бочковидной, в противоположном случае - подушковидной.
В оптической микроскопии перечисленные виды аберраций в значительной степени удается скорректировать высоким качеством изготовления оптики и применением специальных сложных объективов(ахроматические, апохроматические). Однако, полностью исправить все аберрации линз практически невозможно.
ЛЕКЦИЯ №3
