ДНК провируса (ВИЧ-1) состоит из 9283 нуклеотидных пар (н.п.) и фланкирована LTR из 638 н.п.
В составе генома (ДНК-провируса) девять генов, которые контролируют синтез 9 структурных и 6 регуляторных белков:
gag - p17, р24, р7, р6 - эти белки образуют сердцевину вириона;
роl - р10 (протеаза), p66/р51- ревертаза (обратная транскриптаза, РНК-аза Н, ДНК-зависимая ДНК-полимераза), р31 (интеграза, или эндонуклеаза);
env - гликопротеиды оболочки (gp120, gp41).
Указанные девять белков входят в состав вириона.
Регуляторные гены и белки
tat – p14 (TAT); vif – р23 (VIF);
rev – p12 (REV); vpu – p16 (VPU);
nef – p27 (NEF); vpr – - (VPR).
Таким образом, девять генов вируса кодируют синтез 15 белков. Это связано с тем, что некоторые гены имеют экзонно-интронную структуру и имеют несколько рамок считывания.
Схематическое расположение генов вируса можно изобразить следующим образом:
5`-LTR-gag-pol-vif-vpr-tat-rev-vpu-env-nef-3`-LTR
Сложность работы генома вируса связана с наличием в LTR специальных регуляторных элементов:
а) сигнал транскрипции (область промотора);
б) сигнал добавления поли-А;
в) сигнал копирования;
г) сигнал интеграции;
д) элемент позитивной регуляции (TAR для белка ТАТ);
е) элемент негативной регуляции (NRE для белка NEF);
ж) участок прикрепления затравочной РНК (тРНКлиз) для синтеза минус-цепи ДНК на 3’-конце; сигнал на 5’-конце LTR, который служит затравкой для синтеза плюс-цепи ДНК.
3. Взаимодействие вируса с клеткой протекает по следующей схеме: адсорбция вируса на клетке, имеющей рецептор CD4 - окаймленная ямка - окаймленный пузырек - лизосома - слияние мембран - выход нуклеокапсида в цитоплазму - синтез обратной транскриптазой минус-цепи ДНК - разрушение РНК-азой Н вирионной РНК - синтез ДНК-полимеразой плюс-цепи ДНК - образование LTR - проникновение ДНК-провируса в ядро (в хромосому с помощью интегразы). Активация вируса - синтез полноразмерных и субгеномных РНК клеточной РНК-полимеразой - протеолиз и процессинг env-белков - синтез других белков - ассоциация двух молекул геномной РНК с капсидными белками - включение двух молекул РНК (а также двух молекул затравочной тРНК и pol- белков) в капсид - мембрана клетки - липидная оболочка - белки gp4I и gpI20 - отпочкование вирионов - образование симпластов из Т-лимфоцитов - их гибель. Далее развивается иммунодефицит - нарушение других систем - присоединение оппортунистических инфекций.
Заражение вирусом - начало вирусоносительства. Активация Т-лимфоцита (и, соответственно, вируса) каким-либо антигеном - начало болезни.
4. Вирусологический диагноз ВИЧ-инфекции трудно осуществим, так как животные к вирусу не чувствительны, а вирус размножается только в одном клоне лимфоцитов (Н9), которых лаборатории не имеют. Наличие вируса или его антигенов можно обнаружить с помощью некоторых иммунологических реакций, но для этого требуются специфические антитела, получение которых связано с большими трудностями. Широко используется ПЦР.
5.а) Основным скрининговым методом диагностики ВИЧ-инфекции и особенно выявления вирусоносительства является использование иммуноферментного анализа. Имеющиеся коммерческие тест-системы просты в употреблении, содержат сенсибилизированные антигеном лунки в планшетах, все необходимые ингредиенты и контроли. В силу своей универсальности этот метод получил повсеместное применение. Демонстрация отечественных тест-систем для иммуноферментного определения антител к вирусу иммунодефицита человека. Постановка реакции (методика описана в занятии 17).
Недостатком иммуноферментного метода является то, что нередко он дает ложнопозитивные результаты. Поэтому в случае сомнения такая сыворотка подвергается контрольному испытанию более чувствительными специфичными методами, например с помощью метода иммуноблотинга или иммунопреципитации.
б) Метод иммуноблотинга представляет собой тестирование твердо-фазным иммунологическим анализом электрофоретически разделенных белков. Реакция ставится в следующей последовательности: электрофоретическое разделение анализируемого материала на индивидуальные белки или полипептиды в геле; получение реплики путем переноса исследуемых белков с геля на твердофазный матрикс; блокирование незанятых центров связывания белков матрикса; инкубирование со специфической тест-сывороткой; отмывка от избытка сыворотки; инкубирование с меченым иммунореагентом на антитела специфической сыворотки; отмывка от избытка меченого иммунореагента; выявление тестируемых белков или полипептидов с помощью метки иммунореагента.
Для разделения анализируемого материала используют чаще всего различные варианты электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ).
После электрофоретического разделения белков их иммобилизуют на твердой фазе (матриксе), в качестве которой в основном применяют нитроцеллюлозные мембраны (НЦМ). На ПААГ помещают НЦМ и проводят электрофоретический перенос в перпендикулярном к гелю направлении.
На полученной нитроцеллюлозной реплике блокируют активные центры связывания во избежание неспецифической адсорбции реагентов. С этой целью НЦМ инкубируют с раствором бычьего сывороточного альбумина в концентрации 2-5% в течение 1-2 часов.
После блокирования активных мест связывания НЦМ инкубируют с эмпирически подобранным разведением специфической сыворотки (т.е. заведомо положительной сывороткой), причем время инкубирования изменяется в широком диапазоне в зависимости от авидности компонентов. Обычно инкубирование в течение двух часов при 37°C или в течение ночи при 4°C дает хорошие результаты. НЦМ несколько раз отмывают блокирующим раствором от неспецифически адсорбированной сыворотки и тестируют специфические антитела одним из методов твердофазного иммунного анализа, чаще всего используют ИФМ или РИМ. В том и другом случае НЦМ после обработки специфической сывороткой инкубируют с меченными ферментом антивидовыми антителами, в качестве метки используют пероксидазу хрена (ИФМ) либо радиоактивный йод (РИМ).
После отмывки физиологическим буфером избытка меченых антител на заключительном этапе проведения иммуноблотинга выявляют тестируемые антитела по ферментативной реакции с соответствующим субстратом или авторадиографическим методом.
Приложение к ЗАНЯТИЮ 15
А. Вирусные гепатиты
Известны следующие вирусные гепатиты:
1. Гепатит А – возбудитель относится к семейству Picornaviridae, роду Heparnavirus.
2. Гепатит В – возбудитель относится к семейству Hepadnaviridae.
3. Гепатит С – вызывает флавивирус.
4. Дельта-гепатит- - эпидемиологически сходен с гепатитом В, но вызывается дельта-вирусом – дефектным вирусом – вирусом-сателлитом вируса гепатита В.
5. Гепатит Е – заражение происходит, как при гепатите А, фекально-оральным механизмом, но возбудитель отличается от вируса гепатита А.
6. Гепатит G – возбудителем является дефектный флавивирус – сателлит вируса гепатита С.
7. Гепатит ТТ – возбудителем является вирус семейства Circinoviridae.
8. SEN-гепатиты.
Б. Культивирование вирусов гепатитов удается с большим трудом и требует соблюдения ряда условий. Например, в нашей стране разработан метод культивирования вируса гепатита А в культуре клеток 4647 (перевиваемая линия клеток эпителия почек зеленых мартышек).
В. Для профилактики гепатита А созданы различные вакцины:
1. Цельновирионные из ослабленных или инактивированных (формоловые) вирусов вакцины.
2. Субвирионные вакцины.
3. Вакцины химические (из химических аналогов антигенных детерминант вируса).
4. Генно-инженерные вакцины (гены вируса гепатита А рекомбинированы в геном вируса осповакцины).
Одним из важных условий борьбы с гепатитом В в глобальном плане, по мнению ВОЗ, является массовая иммунизация новорожденных и детей раннего возраста. Полный курс иммунизации против гепатита В состоит из трех прививок: первая доза вводится сразу после рождения, вторая через 1-2 месяца и третья - до конца первого года жизни ребенка.
Для вакцинации против гепатита В применяется два типа высоко эффективных вакцин: плазменная вакцина (плазма хронических носителей вируса содержит огромное количество поверхностного антигена вируса гепатита В, он извлекается и надежно обезвреживается) и рекомбинантная генно-инженерная вакцина, которая готовится на основе рекомбинантного клона дрожжей, несущего гены НВsАg.
З А Н Я Т И Е16
Дата ______________
Тема: Итоговое контрольное занятие «Частная вирусология»
Вопросы к итоговому занятию по частной вирусологии
1.Что собой представляют вирусы, являются ли они живыми существами или неживыми структурами?
2.Чем характеризуются арбовирусы? Какие типы флавивирусов вызывает клещевой весенне-летний энцефалит и омскую геморрагическую лихорадку?
3.Какие механизмы лежат в основе противовирусного иммунитета?
4.Каким образом бактериофаг может изменить генетические свойства бактерий?
5.Каким образом происходит проникновение вируса в клетку?
6.Каковы методы микробиологической диагностики клещевого энцефалита?
7.Как распознают Т-киллеры клетки, инфицированные вирусом?
8.Что такое первично-трипсинизированные культуры клеток и перевиваемые культуры клеток?
9.Какие вакцины применяют для профилактики гриппа?
10.Из каких структурных компонентов состоят вирусы? Что такое вирион? капсомер? нуклеокапсид? суперкапсид?
11.Какую роль играют в патологии человека вирусы Коксаки и ECHO?
12.Каким образом некоторые (какие?) РНК-содержащие вирусы могут интегрировать свой геном в хромосому клетки?
13.Чем отличаются вирусы от всех прочих живых существ?
14.Изменение каких наружных белков вируса гриппа приводит к появлению пандемических вариантов его и почему?
15.Каковы методы диагностики заболеваний, вызываемых энтеровирусами?
16.Каким образом онкогенные вирусы вызывают трансформацию нормальных клеток в злокачественные? Что такое протоонкоген и онкоген?
17.Каким способом происходит заражение вирусом гепатита В? Какие формы вирусных гепатитов Вы знаете?
18.Как устроен вирус гриппа? Каковы особенности его генома? Перечислите белки, входящие в состав нуклеокапсида.
19.Почему для диагностики вирусного гепатита А наиболее приемлемой является методика "захвата"антител, относящихся к IgM?
20.Почему вирусы являются облигатными паразитами?
21.С какой целью производится фаготипирование бактерий, например, стафилококков?
22.Каким образом можно выделить от больного гриппом возбудителя и установить его серотип?
23.Какие Т-лимфоциты обеспечивают защиту организма от вирусов?
24.Как устроен вирус дельта-гепатита? Особенности его нуклеиновой кислоты?
25.С какими целями используют бактериофаги в медицинской практике?
26.Как устроен вирус полиомиелита и каковы способы заражения этим возбудителем?
27.С помощью какой серологической реакции можно определить наличие вируса иммунодефицита в организме человека и в чем сущность этой реакции?
28.Каков механизм реакции торможения гемагглютинации?
29.Какие существуют методы культивирования вирусов? Как типируют (идентифицируют) вирусы?
30.Как устроен вирус иммунодефицита человека?
31.Что такое иммуноблотинг и для какой цели он применяется?
32.Из каких основных этапов складывается процесс взаимодействия ВИЧ с клеткой?
33.Какие вирусы являются возбудителями острых респираторных заболеваний (ОРЗ)?
34.Почему лица, пораженные вирусом иммунодефицита, становятся легко восприимчивыми к различным, даже слабо патогенным, микроорганизмам, иначе говоря, почему у них часто развиваются оппортунистические инфекции?
35.Какие типы антигенной изменчивости вируса гриппа Вы знаете и каково их значение в эпидемиологии этой болезни?
36.Как осуществляется специфическая профилактика бешенства? Какой препарат применяют сейчас для этой цели и в каких случаях?
37.По каким признакам можно судить о размножении вирусов в культуре клеток?
38.Какие методы применяются для диагностики вирусного гепатита А?
39.Как проникает в организм вирус гриппа и из каких основных этапов складывается процесс его внутриклеточного размножения?
40.Каков механизм развития иммунодефицита человека в результате заражения его ВИЧ?
41.Какие клетки организма поражает вирус иммунодефицита и какой рецептор имеют эти клетки?
42.Какая иммунологическая реакция применяется для обнаружения поверхностного антигена (HBsAg) вируса гепатита В у больных и вирусоносителей?
43.Каково значение гемагглютининов вируса гриппа?
44.Как устроены аденовирусы, чем представлен их геном; какие заболевания вызывают аденовирусы?
45.В чем заключается сущность иммуноферментнсго метода (ИФМ) диагностики инфекционных заболевании?
46.Какие вакцины используются для создания активного коллективного иммунитета против гепатита В?
47.Каков механизм противовирусного действия интерферона?
48.Каковы особенности репликации вирусов, у которых геном представлен однонитчатой РНК?
49.Какова особенность серологической диагностики гриппа? Как ставится и оценивается соответствующая реакция?
50.Что собой представляет возбудитель дельта-гепатита?
51.Как происходит заражение гепатитом В?
52.Какая разница между позитивным и негативным вариантами однонитчатых РНК-геномов и механизмами их репликации?
53.Какие серологические реакции можно использовать для диагностики вирусных инфекций?
54.Чем характеризуется возбудитель гепатита А?
55.Какие клетки поражает вирус иммунодефицита человека и как он распознает их, т.е. какие рецепторы содержат эти клетки для вируса.
56.Особенности современной вакцинопрофилактики полиомиелита.
57.Какие вирусы вызывают острые кишечные заболевания (ОКЗ)?
58.Как устроен вирус-возбудитель гепатита В? Какую роль играет содержащаяся в вирионе обратная транскриптаза?
59.Что произойдёт, если человеку перорально ввести вирулентный дизентерийный бактериофаг?
60.Что собою представляет "Гриппол"? Полиоксидоний.
61.Из каких основных этапов складывается процесс взаимодействия вируса с клеткой?
62.Каковы особенности размножения ретровирусов, почему они получили такое название?
63.Что такое лизогения и лизогенная конверсия и какими фагами она вызывается -вирулентными или умеренными?
64.В каком возрасте делают прививки против полиомиелита? Какие при этом применяют вакцины?
65.Какие типы вирусных геномов Вы знаете?
66.Каковы механизмы персистирования вирусов в организме человека?
67.Почему сейчас большое внимание уделяется острым вялым параличам? Какие вирусы их вызывают?
68.Стратегия вакцинопрофилактики гепатита А. Схема вакцинации.
З А Н Я Т И Е17
Дата ______________
Тема: Внутрибольничные инфекции. Оппортунистические инфекции. Специфическая и неспецифическая профилактика инфекционных
