На рубеже XV - XVI вв. взаимоотношения Литвы и Руси вновь обостряются: происходит серия русско-литовских войн. В Литве и Польше вновь выходят постановления, ущемляющие положение православных. Несмотря на это, на территории Люблина, Белостока и Жешова большая часть населения продолжала исповедовать православие.
В 1569 г. была заключена Люблинская уния, закреплявшая решения Городельского сейма. Уния положила конец самостоятельности Литовского княжества: отныне оно окончательно входило в состав Польского государства. Объединенное польско-литовское государство стало именоваться Речью Посполитой. Православное население Белоруссии и Западной Украины, оказавшееся в составе Польши, начало испытывать гнет католицизма.
Угнетения и преследования заставляли православных переходить в унию или прямо в католичество, так как, отказавшись от Православия, можно было получить различные льготы, административные должности. Перед православной шляхтой стоял выбор: либо сохранять верность Православию и отказаться от всех сословных преимуществ, либо принять католичество и удержать за собой эти сословные преимущества. В итоге к концу XVII в. православная шляхта в Польше почти вся перешла в католичество.
Брестская уния 1596 г. поставила последнюю точку в объединении Польши и Литвы и провозглашении католичества господствующим вероисповеданием. Кроме того, большая часть православной иерархии во главе с митрополитом Киевским Михаилом Рогозой приняла Брестскую унию и признала над собой власть Рима. Это было время самых тяжелых испытаний для православных. Если до этого Православная Церковь не подвергалась открытым массовым гонениям, то с конца XVI в. отношение к ней властей новообразованной Речи Посполитой резко ужесточилось, приобретая воинственный, беспощадный характер.
После Брестского Собора до 1632 г. Православная Церковь в Речи Посполитой официально была объявлена вне закона. Однако православный народ боролся против унии, борьба охватила все население Украины и Белоруссии, сохранявшее верность Православию.
Реакцией на притеснения послужило возникновение православных братств: Львовского (с 1585 г.) и Виленского (с 1588 г.). Главными задачами братств являлись: открытие и содержание духовных училищ, подготовка юношей в качестве защитников Православной веры и Церкви, учреждение типографий и издание необходимых церковных книг. В результате в лице братств возникла новая церковно-общественная сила, способная благотворно влиять на все стороны церковной жизни. За уход в унию кого-либо из членов братства следовало отлучение от Церкви.
На протяжении XVI – XVII вв. численность православных храмов в пределах Западной Украины, Белоруссии, Польши и Литвы заметно сокращается, намечается четкая тенденция перехода их в собственность униатов. В Вильно, например, из более чем 14 церквей, существующих на конец XVI в., к 1630-м гг. осталась лишь 1 – Свято-Духовская. Аналогичная ситуация была в Минске, Новогрудске, Перемышле и других городах. В Белоруссии единственным православным центром был г. Могилев.
После того, как в 1686 г. Киевская митрополия вошла в состав Московского Патриархата, Киев становиться православным центром на Украине.
В XVI - XVIII вв. главными очагами Православия оставались монастыри, в основном на территории Западной Украины – Яблочинский Свято-Онуфриевский, Троицкий и Преображенский в Дрогочине, а также монастыри в районе Слуцка, Пинска. Здесь, в этих «православных оазисах» западнорусское население черпало спасительную силу святого Православия. В повседневной жизни для православных частыми были случаи, когда священники приглашались из соседних государств (Буковины, Венгрии, Болгарии, Греции).
В1732 г. польско-литовские власти наложили официальный закон на публичное оглашение Православной веры, из жизни церквей изгонялся колокольный звон, хоронить мертвых разрешалось только ночью. В 1764 г. сейм вынес постановление, по которому карались смертью те, кто переходил из католичества в Православие.
Ситуация начала меняться в последней трети XVIII в., когда Речь Посполитая стала ареной разделов между европейскими державами – Пруссией, Австрией и Россией. В результате трех разделов Польши Пруссия захватила 20 % территории, Австрийская империя – 18 %, а к России отошло ок. 62 % территории с 45 % населения.
