Полимеразная цепная реакция

 

Принцип метода основан на естественной репликации ДНК, которая включает:

- денатурацию спирали ДНК, 

- расхождение нитей  

-комплементарный с интез новых нитей ДНК. 

ПЦР обеспечивает амплификацию фрагментов генома и быстрое накопление определенной последовательности ДНК. В результате получают большое количество ДНК, которое достаточно для проведения анализа различными методами детекции.

    Для реализации реакции используют набор праймеров-фрагментов ДНК, которые являются маркерами данного возбудителя. При добавлении такого праймера к пробе исследуемого материала, содержащую денатурированную одноцепочечную ДНК возбудителя, происходит их соединение с комплементарным участком ДНК. Образовавшиеся двунитевые фрагменты ДНК служат матрицей для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации и так повторяется много раз, поэтому реакция носит цепной характер. За 2-3- часа происходит 30-40 циклов амплификации, что приводит к образованию большого количества соответствующих копий нуклеотидных последовательностей, которое можно зарегистрировать.

Компоненты реакции:

1.Праймеры-олигонуклеотиды, которые состоят из 15-30 нуклеотидов, комплиментарных участкам на идентифицируемой матричной ДНК.

2. Смесь        дезоксинуклеотидтрифосфатов,которые являются    строительным материалом, используемым Tag -полимеразой для синтеза второй цепи ДНК.

3. Tag -полимераза обладает ДНК- полимеразной термостабильной активностью.

Оптимум ее действия при 72⁰ С. Она способна удленнять праймеры, присоединяя их к 3^/ концу.

4. Буферный раствор, катализатор фермента Tag -ДНК- полимеразы.

5. Исследуемый образец - препарат, который служит мишенью для последующей амплификации. Метод ДНК-чипов

Одним из основных методов лабораторной диагностики инфекционныхзаболеваний является серологическое обследование пациентов с цельювыявления антител к отдельным возбудителям.

При смешанных инфекциях, когда организм поражается сразу несколькимивозбудителями, а так же при дифференциации заболеваний, имеющих сходнуюклиническую картину, часто бывает необходимо выполнение иммунологическихтест-систем - ИММУНОЧИПОВ.

Иммуночипы для многопрофильногоанализа антител представляет собойплотную подложку, на поверхности которой дискретно нанесены в определенномпорядке антигены различных возбудителей инфекционных заболеваний.Результаты после выполнения анализа на иммуночипах расшифровываются поналичию сигнала в определенных зонах нанесения антигенов.

 

Молекулярно-генетическое секвинирование

Эти методы позволяют анализировать только небольшую часть хромосомымикроорганизма, которая может варьировать у разных штаммов бактерий.Такая часть анализируемой ДНК должна быть информационно значимой длятипирования различных штаммов определенного вида. Нуклеотидныхпоследовательностей, удовлетворяющих всем требованиям, немного. В связи сэтим широкое использование методов секвинирования для типированияпатогенных бактерий будет возможно только после того, как для каждого видавозбудителей будут идентифицированы видоспецифические генетическиелокусы, на основании которых можно дифференцировать штаммы.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

БАКТЕРИОФАГИ

Бактериофаги –вирусы бактерий. В зависимости от формы и структурнойорганизации фаги подразделяют на несколько морфологических типов:

- нитевидные- кубические

- сперматозоидные.

    Наиболее изучены бактериофаги, имеющие форму сперматозоида исокращающийся чехол отростка. Они состоят из головки и хвостового отростка.Хвостовой отросток имеет внутри полый цилиндрический стержень, которыйсообщается с головкой, а снаружи – чехол, способный к сокращению. Надистальном конце отростка имеется базальная пластинка с шипами, от которыхотходят фибриллы.

Бактериофаги содержат или ДНК или РНК, чаще замкнутую вкольцо.Содержат группоспецифические и типоспецифические антигены. Потипоспецифическим антигенам фаги делят на серотипы.

Взаимодействие бактериофага склеткой происходит в соответствии сосновными типами взаимодействия, характерными для вирусов:

-при продуктивном типе взаимодействия образуется фаговое потомство,бактерии лизируются;

-при абортивном типе – фаговое потомство не образуется и бактерии сохраняютсвою жизнедеятельность;

- латентная

-при интегративном типе – геном фага встраивается в хромосому бактерии исосуществует с ней.

В зависимости от типа взаимодействия различают:

-вирулентные (литические) фаги, вызывающие продуктивную инфекцию и лизисбактериальной клетки;

- умеренные фаги – вызывающие латентную инфекцию и ассоциацию геномавируса с бактериальной хромосомой.Умеренные фаги в отличие от вирулентных,не вызывают гибель бактериальной клетки и при взаимодействии с нейпереходят в неинфекционную форму фага – ПРОФАГ – это геном фага,ассоциированный с бактериальной хромосомой. Профаг, ставший частьюхромосомы клетки, при ее размножении реплицируется синхронно с геномомбактерий и передается по наследству от клетки к клетке.

Бактериальные клетки, содержащие в своей хромосоме профаг, называютсялизогенными. Профаг в лизогенных клетках самопроизвольно или под влияниемразличных индуцирующих агентов может переходить в вегетативный фаг. Врезультате такого превращения бактериальная клетка лизируется и продуцируетфаговые частицы. В ходе лизогении бактериальные клетки приобретают новыепризнаки, детерминируемые геномом вируса. Такое явление - изменениесвойств микроорганизмов под влиянием профага – называется фаговой илилизогенной конверсией.

Некоторые умеренные фаги называются трансдуцирующими, так как с ихпомощью осуществляется один из механизмов генетической рекомбинациибактерий – трансдукция.

По признаку специфичности выделяют:

- поливалентные бактериофаги, лизирующие культуры одного семейства илирода бактерий;

- моновалентные – лизирующие культуры только одного вида;

- типовые – способные вызывать лизис только определенного типа (варианта)бактеральной культуры внутри вида.

Практическое использование явления бактериофагии.

1.Фаготипирование – определение фаготипов бактерий и сравнение фаготиповвыделенных от больного и от окружающих его лиц. с помощью этого методаможно установить источник и путь передачи инфекционного заболевания.

2. Применения бактериофагов в качестве диагностических препаратов дляустановления рода и вида бактерий, выделенных в ходе бактериологическогоисследования.