РАБОТЫ:
ОПЫТ 1. Разделение медпрепаратов методом бумажной хроматографии (демонстрационный)
В пробирку налейте по 1 мл Н2О, толуола и 10 капель смеси, состоящей из растворов I2 и бриллиантового зеленого. Пробирку закройте пробкой и хорошо встряхните. Смесь разделится на две окрашенные зоны. Затем на полоске фильтровальной бумаги проведите стартовую линию карандашом на расстоянии 1 см от края. Поставьте точку в центре линии стеклянной палочкой, смоченной смесью I2 и «зеленки».
В стакан (100-150 мл) налейте 5 мл смеси растворителей (Н2О + толуол), опустите в эту смесь конец бумажной полоски и оставьте на некоторое время. Когда будет ясно видно два цветных пятна на бумаге, отметьте карандашом фронт распространения растворителя. Проведите прямую через центр нанесенной капли и образовавшихся пятен, измерьте расстояние от центра нанесенной капли до центра каждого пятна и занесите в табл. 12 полученные результаты.
Таблица 12
| Название компонента смеси | Длина пути компонента | Длина пути фрон- та растворителя | Величина коэффициента подвижности |
Объясните распространение цветных пятен, учитывая, что бумага отрицательно заряжена, вода полярный, а толуол неполярный растворитель.
ОПЫТ 2.
а) Разделение красителей методом бумажной
хроматографии
В стакан (100-150 мл) налейте 0,1 М раствор NaOH. Фильтровальную бумагу вырежьте полоской 30 мм и укрепите на проволоке. Простым карандашом нанесите стартовую линию на расстоянии 3 см от нижнего края полоски и финишную линию для растворителя на расстоянии от стартовой линии 7-8 см. На стартовой линии отметьте карандашом центры для четырех капель. Хорошо отточенными спичками нанесите чистые красители в отмеченные центры в следующей последовательности от левого края бумаги: 1) тимоловосиний; 2) метилкрасный; 3) фуксин.
На предметное стекло нанесите по 1 капле фуксина и метилкрасного и 2 капли тимоловосинего красителя, а затем чистой спичкой перемешайте капли и также нанесите смесь на подготовленную бумажную полоску. Затем опустите бумажную полоску с нанесенными каплями в стакан с раствором 0,01 М NaOH таким образом, чтобы проволока лежала на краях стакана. Когда фронт растворителя достигнет финишной прямой, выньте полоску из стакана и аккуратно подсушите над электроплиткой. Проведите параллельные прямые из центра капель до финишной прямой и замерьте это расстояние до центра каждого цветного пятна. Заполните такую же таблицу, как в опыте 1. 
Учитывая, что формула фуксина
или: R(NH2)+3Cl-
тимолового синего
или: R/−SO3H(α1)
и метилового красного СООН
или: R//−COOH(α2),
объясните распределение цветных пятен, если бумага отрицательно заряжена.
б) Разделение сахаров методом круговой бумажной
хроматографии
Выполнение: в фильтре диаметром 12-13 см вырежьте от края к центру полоску шириной 4-5 мм и отогните ее под прямым углом к плоскости фильтра. На расстоянии 0,5 см от центра фильтра по кругу нанесите капилляром раствор смеси сахаров и растворы чистых сахаров («свидетели»). Места нанесения капель (старт) отметьте предварительно карандашом. Капли аккуратно подсушите над электроплиткой. В чашку Петри налейте 10 мл смеси растворителей: бутанол-ацетон-вода (соотношение 7:2:1) и сверху поместите фильтр, погрузив вырезанный сектор в растворитель. Бумагу прижмите второй чашкой Петри. Когда фронт жидкости дойдет до края чашки, бумагу высушите и проявите сахар анилинфталатом. Зарисуйте хроматограмму. Данные занесите в табл. 12, как в опыте 1.
1. Дайте оценку использованного метода распределения по механизму и технике выполнения.
2. Укажите, какие из растворителей выполняют роль подвижных и неподвижных.
3. Укажите, какой компонент смеси обладает большей подвижностью и почему.
в) Разделение α-аминокислот методом радиальной бумажной хроматографии
Радиальную хроматографию проводят на бумаге в чашке Петри. Растворитель перемещается от центра к периферии и захватывает аминокислоты, которые распределяются на концентрических кругах и обнаруживаются после высушивания бумаги и обработки нингидриновым реактивом.
Выполнение: в фильтре диаметром 12-13 см вырежьте в центре отверстие диаметром 1,0 см. Простым карандашом разделите круг на четыре части и поместите его на ножку из фильтровальной бумаги в виде трубочки высотой 2 см, вставленной в отверстие диска. Диск держите за края, чтобы избежать появления пальцев на хроматограмме.
Отступив от центра 1 см в каждом секторе, отмерьте карандашом растворы индивидуальных α-аминокислот (1,2,3) и раствор их смеси (4). Бумагу просушите на воздухе в течение 10 мин.
На дно чашки Петри налейте 10 мл раствора смеси растворителей: бутанол-уксусная кислота-вода (соотношение 4:1:1) и сверху поместите фильтр, чтобы ножка упиралась в дно.
Бумагу накройте плотно второй чашкой Петри. Когда фронт жидкости дойдет до края чашки, бумагу пинцетом поместите в сушильный шкаф на 10 мин (90-100 оС) или просушите над электроплиткой.
Для выявления пятен хроматограмму опрыскайте нингидриновым раствором или сухую хроматограмму одним движением смочите раствором нингидрина, налитого в чашку Петри. Хроматограмму поместите на 5 мин в термостат с целью удаления растворителя и фиксации аминокислоты в виде отдельных полос, окрашенных в розово-фиолетовый цвет, где каждое пятно соответствует определенной аминокислоте. Зарисуйте хроматограмму или данные ее занесите в табл. 12.
ОПЫТ 3. Разделение ионов Fe 3+, Cu 2+, Co 2+ методом колоночной хроматографии
На чистом предметном стекле смешайте по 2 капли растворов солей Fe2(SO4)3, CuSO4, Co(NO3)2. Чистой пипеткой по 1 капле (но не более трех капель) закапывайте в центр колонки с оксидом алюминия. Каждый ион в колонке образует определенное место (зону). Зарисуйте полученную хроматограмму и укажите положение зоны каждого иона смеси. Дайте оценку использованного метода разделения по механизму и технике выполнения. Объясните положение окрашенных зон в колонке.
ОПЫТ 4. Выделение из мочи хлоридов методом ионообменной хроматографии (демонстрационный)
В стаканчик налейте 4-5 мл мочи (разбавлена в 15 раз) и определите рН с помощью индикаторной бумаги. Медленно пропустите мочу через колонку с анионитом. Определите рН вытекающего раствора (по индикаторной бумаге). Затем колонку промойте водой до рН = 7, после чего извлеките ионы С1-. Для этого медленно пропустите через колонку 4 мл 1 М раствора NaOH.
Качественной реакцией с AgNO3 (1-2 капли) проверьте наличие ионов С1- в элюате. По окончании опыта промойте колонку водой до рН = 7 по индикаторной бумаге.
Напишите уравнения реакций ионного обмена при поглощении и элюировании.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:
1. Какие виды хроматографии вам известны?
2. Преимущество применения хроматографии перед другими методами анализа.
3. Разделите бром тимоловый синий и метиловый фиолетовый, зная, что их формулы R-SO3H и R//=N+(CH3)2Cl-. Объясните распределение окрашенных зон, если адсорбент (бумага) имеет отрицательный заряд.
4. Выделите ионы Са2+ из плазмы крови на катионите в Н-форме.
5. Разделите Hg2+ и Со2+ на колонке с А12О3. Напишите уравнения реакций, если проявить колонку NaOH до поглощения катионов. Напишите качественные реакции на Hg2+ и Со2+ с NaOH. Объясните предполагаемое положение окрашенных зон. укажите вид хроматографии по механизму и технике.
ОБРАЗЕЦ ОТВЕТА НА КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:
ВОПРОС: Как, пользуясь методом ионообменной хроматографии, выделить из плазмы крови ионы Са2+? Укажите все стадии процесса и подтвердите их соответствующими уравнениями реакций.
ОТВЕТ: 1. Для перевода катионита в Н-форму колонка со смолой должна быть предварительно выдержана в растворе кислоты.
2. Для того чтобы убрать лишнюю кислоту, колонку промывают водой до тех пор, пока рН вытекаемой жидкости не станет равным 7.
3. Через колонку пропускают раствор плазмы крови, содержащей ионы Са2+. Происходит стадия сорбции: 2R-H + Ca2+ → R2Ca + 2H+. Универсальной индикаторной бумагой проверяют содержащиеся в элюате Н+: рН < 7. Процесс необходимо вести в динамическом режиме.
4. Затем колонку промывают вновь водой, чтобы отмыть ее от частиц, не адсорбированных на сорбенте.
5. Затем проводят стадию десорбции (элюирования): R2Ca + 2H+ → 2R-H + Ca2+. Колонка восстанавливает Н-форму и готова к работе. Ионы Са2+ можно подтвердить в элюате реакцией взаимодействия в щелочной среде (аммиачный буфер) с металл-индикатором хромоген черный, окрашивающим раствор в розовый цвет.
ЛИТЕРАТУРА:
1. С. 446-449; 3. С. 168-174; 5. С. 107-113; 6. С. 702-707.
РАБОТА 11. СТРУКТУРООБРАЗОВАНИЕ.
ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКАЯ ТОЧКА БЕЛКОВ
В организме человека и животных многие жидкости и плотные ткани содержат высокомолекулярные соединения, среди которых наибольшее значение имеют белки. Белки – полимеры аминокислот – являются полиэлектролитами. Каждый белок характеризуется определенным значением рН, когда он является нейтральной частицей (рНИЭТ). Величина рНИЭТ различных белков колеблется в широких пределах.
Реакция крови сдвинута в щелочную сторону от рНИЭТ белков плазмы и гемоглобина, поэтому эти белки находятся в крови в виде анионов. Являясь сильными сопряженными основаниями, они связывают кислые продукты метаболизма и играют существенную роль в механизме буферного действия крови. В клиническом анализе при электрофоретическом разделении белков сыворотки крови, мочи, спинномозговой жидкости величину рНИЭТ необходимо знать при выборе поддерживающей среды.
В живом организме примером студней, образованных ВМС, могут служить протоплазма клетки, хрусталик глаза. Процессы обезвоживания и набухания ВМС наблюдаются при регенерации тканей, отеках, воспалениях. Процессы старения белков связаны со структурообразованием полимеров. Биологическое значение процессов старения студней проявляется в изменении проницаемости клеточных мембран, что вызывает нарушение обмена клетки с окружающей средой. Образование слоистых камней в желчном пузыре и почках объясняется периодичностью химических реакций в студнях. Этим же свойством студней пользуются при иммунологических методах исследований плазменных и сывороточных белков (образование преципитатов при реакциях между антителами и антигенами).
Полученные знания помогут студентам-медикам при изучении курсов нормальной анатомии (создание искусственных органов), хирургии (применение искусственных органов), микробиологии (искусственные среды), гигиены питания, фармакологии (изучение лекарственных форм).
ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ:
1. Освоить экспериментальные методы определения изоэлектрической точки белков.
2. Научиться получать студни и гели.
3. Ознакомиться с явлениями синерезиса и периодических структур.
ЗАДАНИЕ:
Выполните пять опытов, дайте объяснения механизма и напишите уравнения реакций в демонстрационных опытах.
ЗАДАНИЕ 1.
Определите рН изоэлектрической точки по набуханию.
ЗАДАНИЕ 2.
Определите рН изоэлектрической точки по высаливанию (осаждение).
ЗАДАНИЕ 3.
Определите ИЭТ белка методом электрофореза (демонстрационный).
ЗАДАНИЕ 4.
Получите гель кремниевой кислоты, покажите необратимость процесса гелеобразования.
ЗАДАНИЕ 5.
Получите студень желатина и докажите обратимость студнеобразования.
ЗАДАНИЕ 6.
Дайте объяснение периодическим реакциям в студнях.
ЗАДАНИЕ 7.
Объясните явление синерезиса в студнях на примере крахмала.
