Принципы микробиологической диагностики

Туберкулёз — хроническая инфекция, проявляющаяся пораже­ниями органов дыхания, костей, суставов, кожи, мочеполовых орга­нов и др. Заболевание под названием чахотки известно с глубокой древности. Лёгочная форма туберкулёза описана античными авторами (Аретёй Каппадокййс-кий, Гиппократ). Рост городов, скученность населения и низкий санитарный уровень жизни привели к тому, что в XVIII-XIX вв. туберкулёз поражал различные слои населения: достаточ­но вспомнить Моцарта, Шопена, Некрасова, Чехова. «Чахоточный вид» даже вошёл в моду, и дамы затягивались в корсеты, пили уксус «для томной бледности» и закапывали белладонну в глаза «для лихорадочного блеска». Инфекционную природу заболевания доказал Вильмён (1865). Важнейшим этапом в изучении и совершенствовании мер борьбы с туберкулёзом стало откры­тие Кохом М. tuberculosis (1882).

Эпидемиология. Резервуар возбудителя — больной человек; основной путь заражения — аэрогенный, реже через кожу и слизистые оболочки. Проникновение возбудителя не всегда вызывает развитие заболевания; огромную роль играют неблагоприятные условия жизни и тру­довой деятельности. Наблюдаемый в настоящее время в России рост заболеваемости связан со снижением уровня жизни населения. Существенное значение имеют «старение» населения и увеличение числа лиц с нарушениями резистентности организма к инфекциям. Особую роль в передаче возбудителя играет скученность населения; особенно в лагерях беженцев, следствен­ных изоляторах, тюрьмах и т.д. С другой стороны, усиливается активность возбудителя, обус­ловленная вытеснением естественных конкурентов в результате применения антимикробных средств. В благополучных странах заболеваемость в 1985-1992 гг. возросла на 20% и ежегодно в мире регистрируют 8-10 млн случаев первичного инфицирования. Высокое содержание ли-пидов и восков в клеточной стенке обеспечивает устойчивость возбудителя к различным воздействиям. В молоке он погибает при температуре 60 °С через 15-20 мин; при аналогич­ной температуре в мокроте сохраняется до часа; при кипячении погибает через 5 мин. Пря­мой солнечный свет убивает возбудителя через 45-55 мин, рассеянный свет — через 8-10 сут. М. tuberculosis хорошо сохраняется при высушивании (до нескольких недель). Обыч­ные химические дезинфектанты малоэффективны; 5% раствор фенола убивает М. tuberculosis лишь через 5-6 ч. Возбудитель способен быстро вырабатывать устойчивость ко многим анти­бактериальным средствам.

Морфология и тинкториальные свойства. М. tuberculosis (палочка Коха) — тонкая, пря­мая или слегка изогнутая палочка, размером 1-10x0,2-0,6 мкм, со слегка закруглёнными конца­ми (рис. 22-1). В молодых культурах палочки более длинные, а в старых склонны к ветвлению. Бактерии способны образовывать L-формы, сохраняющие способность к инфицированию, а также фильтрующиеся формы, патогенетическая роль которых остаётся плохо изученной. Капсул не имеют, но образуют микрокапсулу. Методом Цйля-Нильсена окрашиваются в ярко-красный цвет. Содержат кислотонеустойчивые гранулы (зёрна Муха), располагающиеся в цитоплазме.

Культуральные свойства. Туберкулёзные палочки могут расти как в аэробных, так и фа­культативно анаэробных условиях. Повышенное содержание СО (5-10%) способствует более быстрому росту. Оптимальная температура 37-38 °С; рН 7,0-7,2. Нуждаются в присутствии белков, глицерина, факторов роста (биотин, никотиновая кислота, рибофлавин и др.), ионов (Mg²⁺, K⁺, Na⁺, Fe²⁺) и др. Для выращивания наиболее часто применяются глицериновые, карто­фельные с жёлчью, яичные, полусинтетические и синтетические среды. Наиболее оптимальна среда Лёвенштайна-Йёнсена. На средах туберкулёзные палочки обычно образуют R-колонии; под влиянием антибактериальных препаратов бактерии могут диссоциировать с образованием мяг­ких и влажных S-колоний. В жидких средах образуют сухую морщинистую плёнку (на 7-10-е сут­ки), поднимающуюся на края пробирки; среда остаётся прозрачной. В жидких средах выявляют корд-фактор — важный дифференцишьный признак вирулентности. Наличие корд-фактора обус­ловливает сближение бактериальных клеток в микроколониях и их рост в виде серпантинообразных кос. На плотных средах рост отмечают на 14-40-е сутки в виде сухого морщинистого налёта желто­вато-кремового цвета. Зрелые колонии напоминают цветную капусту, крошковатые, плохо смачива­ются водой и имеют приятный запах (рис. 32, см. цветную вклейку). Культуры плохо снимаются со среды, а при прокаливании трещат. Отличительная особенность М. tuberculosis — способность к синтезу значительного количества никотиновой кислоты (ниацина); ниациновый тест — важ­ный метод дифференцировки микобактерий (рис. 33, см. цветную вклейку).

Патогенез поражений и клинические проявления. Ингалированные микобактерий поглощаются альвеолярными макрофагами, транспортирующими их в регионарные лимфатичес­кие узлы. Фагоцитарные реакции носят незавершённый характер, поскольку корд-фактор возбу­дителя повреждает мембраны митохондрий и ингибирует фагосомо-лизосомальное слияние; воз­будитель переживает в цитоплазме макрофагов. Кроме того, корд-фактор тормозит миграцию полиморфно-ядерных фагоцитов, что определяет слабую выраженность воспалительного ответа. По ходу регионарных лимфатических путей формируется первичный туберкулёзный комплекс с развитием гранулём в виде бугорков [отсюда название «бугорчатка», или «туберкулёз» (лат. tuberculum, бугорок)].

• Образование гранулём не имеет характерных особенностей и представляет собой реакцию ГЗТ. В центре каждого бугорка имеется участок творожистого некроза (казеоза), в котором располагаются палочки Коха. Центр некротического очага окружён эпителиоидными и гигант­скими (многоядерными) клетками Пирогбва-Лангханса, а по периметру — лимфоцитами (в том числе плазматическими клетками) и мононуклеарными фагоцитами. Наиболее часто фор­мирование первичного комплекса наблюдают в лёгких (очаг Гона). В гранулёмах размноже­ние возбудителя обычно замедляется или прекращается. В большинстве случаев первичные очаги заживают с полной деградацией содержимого, его кальцификацией и фиброзом парен­химы. Для первичного туберкулёза характерна сенсибилизация тканей метаболитами мико­бактерий. При заживлении первичного очага повышенная чувствительность исчезает, но на­растает выраженность иммунных реакций. В этих условиях возможно диссеминирование воз­будителя из первичных очагов (особенно лимфатических узлов) и формирование очагов-отсевов (послепервичные очаги реинфицирования). Обычно они локализуются в лёгких, поч ках, половых органах и костях.

• При ослаблении иммунитета очаги активизируются и развивается вторичный процесс. Реакти­вация наиболее часто наблюдается у лиц, достигших 55-60-летнего возраста. Провоцируется стрессами, нарушениями питания и общим ослаблением организма. Определённый вклад в патогенез заболевания вносит сенсибилизация организма, вызывающая разнообразные токсико-аллергические реакции у пациентов. В лёгких, бронхах и мелких лёгочных сосудах образу­ются полости, из которых активно отхаркиваются некротические творожистые массы, содер­жащие возбудитель. Клинически реактивный туберкулёз проявляется кашлем, часто с крово­харканьем; снижением массы тела, обильным ночным потоотделением, хроническим субфеб­рилитетом.

• Реже, у ослабленных лиц и пациентов с иммунодефицитами, наблюдают диссеминирован-ный туберкулёз с образованием гранулём в различных органах. Состояние обычно развива­ется после прорыва содержимого гранулёмы в кровоток. Проявления аналогичны таковым при вторичном туберкулёзе, но к ним часто присоединяются поражения мозга и его оболочек. Прогноз неблагоприятный.

• Многообразие форм туберкулёзного процесса обусловило сложность его классификации. В настоящее время клиническая классификация выделяет три основные формы: Туберкулёзная интоксикация у детей и подростков

Туберкулёз органов дыхания, включая первичный туберкулёзный комплекс, поражения внутригрудных лимфатических узлов, плевры, верхних дыхательных путей; очаговый, ин-фильтративный, кавернозный, фиброзно-кавернозный, цирротический туберкулёз лёгких, туберкулёму и др.

Туберкулёз других органов и систем, включая поражения мозговых оболочек, глаз, сус­тавов и костей, кишечника и брюшины; кожи и подкожной клетчатки; органов мочеполовой системы и др.

Принципы микробиологической диагностики. Для диагностики туберкулёза применя­ют бактериоскопические, бактериологические, биологические, серологические и аллергологи-ческие методы, входящие в обязательный диагностический минимум. Материалом для исследо­ваний служат мокрота, отделяемое свищей, моча, СМЖ, испражнения. Микроскопия патологического материала. В мазках, окрашенных по Цйлю-Нйльсену, обнаруживают кислотоустойчивые палочки. Нередко материал содержит мало бактерий и для повышения вероятности их обнаружения используют методы обогащения: центрифугирова­ние и флотацию. В первом случае исследуемый материал обрабатывают смесью растворов NaCl и NaOH, центрифугируют и микроскопируют осадок. Второй метод включает обработку материала смесью NaOH, дистиллированной воды и ксилола (или бензола). Образец энергич­но встряхивают; образующаяся пена всплывает и захватывает микобактерии. Пену отсасыва­ют и готовят мазки. Наиболее результативна люминесцентная микроскопия. Материал обрабатывают аурамин-родамином и бактерии окрашиваются в бело-жёлтый цвет. Для выяв­ления L-форм применяют AT, меченные флюорохромами.

Выделение возбудителя. Достоинство метода — возможность получения чистой культуры, позволяющая её идентифицировать, оценить вирулентные свойства и определить чувстви­тельность к ЛС. Материал засевают, тщательно втирая, на твёрдые питательные среды. Для повышения эффективности выделения и уничтожения контаминирующей микрофлоры приме­няют методы обогащения или обрабатывают материал 6-12% серной кислотой. Основной недостаток бактериологического метода — длительность получения результата (от 2 до 12 нед). В связи с этим разработаны ускоренные микрометоды выделения. Один из распространённых методов, метод Прайса, заключается в следующем. Материал помещают на предметное стек­ло, обрабатывают серной кислотой, отмывают физиологическим раствором и вносят в пита­тельную среду, дополненную цитратной лизированной кровью. Стекло вынимают через 3-4 сут и окрашивают по Цйлю-Нйльсену. При микроскопии обнаруживают микроколонии ми­кобактерии. Вирулентные бактерии образуют змеевидные (рис. 22-2), а невирулентные — аморфные микроколонии. Культуры L-форм выделяют посевом в столбик полужидкой среды и инкубируют при 37 °С 1-2мес. Рост проявляется в виде облачка помутнения с мелкими вкраплениями. Вирулентность выделенной культуры определяют заражением лабораторных животных и по наличию корд-фактора. Последний легко идентифицируют по способности микобактерии связывать нейтральный красный и нильский голубой и удерживать их после добавления щелочи. Вирулентные штаммы удерживают красители, авирулентные — нет. Биологическая проба. Представляет «золотой стандарт» в диагностике туберкулёза. Морс­ким свинкам подкожно или внутрибрюшинно вводят 1 мл исследуемого материала (например, мокрота, отделяемое свищей и т.д.). Через 1-2мес развивается генерализованная инфекция с летальным исходом. Заболевание можно рас­познать раньше — постановкой проб с тубер­кулином (через 3-4 нед) и пункцией лимфати­ческих узлов (лимфадениты обнаруживают уже на 5-10-е сутки после инфицирования). Для вы­деления L-форм проводят множественные пас­сажи на морских свинках. Серологические исследования. Для выяв­ления Аг микобактерий и AT к ним применя­ются РСК, РА, РПГА, агрегатагглютинации и др. Но они либо не обладают необходимой специфичностью, либо требуют дифференци­альной диагностики при получении ложнопо-ложительных реакций с Аг и AT к другим ми-кобактериям.

Кожные пробы с туберкулином. Позво­ляют проводить обследования населения. Включают внутрикожное введение 5 ЕД PPD [от англ, purified protein derivate] — белкового экстракта культуры М. tuberculosis (реак­ция Манту). При положительном результате через 48 ч в месте введения формируется папула диаметром 10мм с гиперемированными краями. Положительная реакция указывает на контакт лица с Аг М. tuberculosis или других бактерий, дающих перекрёстную реакцию. Положительный результат нельзя рассматривать как признак активного процесса. Если папулы имеют меньшие размеры (5-10 мм), то результат считают сомнительным и пробу повторяют с введением 10 ЕД PPD. Если размеры папулы ещё меньше, то реакцию считают отрицательной. Следует помнить, что отрицательная реакция Манту не всегда указы­вает на отсутствие туберкулёзного процесса — у больных с иммунодефицитами реакция обычно также отрицательна.

Лечение. Противотуберкулёзные ЛС разделяют на препараты первого ряда и альтернатив­ные средства. Первая группа включает изониазид, этамбутол, стрептомицин, пиразинамид, ри-фампицйн. Комбинация из двух препаратов обычно позволяет преодолеть химиорезистентность возбудителя. Альтернативные средства — канамицин, циклосерин, ПАСК, этионамид, виоми-цин, капреомицин и тиоацетазон.

Профилактика. Включает соблюдение элементарных правил гигиены, а также проведение специализированных мероприятий по диспансеризации больных лиц и широкомасштабному профилактическому обследованию населения. При положительной кожной пробе и отсутствии признаков активного процесса назначают изониазид курсом до года. Для специфической имму­нопрофилактики применяют аттенуированный штамм М. bovis\ так называемые бациллы Каль-мётта-Герёна (БЦЖ). Иммунизацию проводят внутрикожным введением 0,1 мл вакцины всем новорождённым. После вакцинации на некоторое время отказываются от постановки кожных проб для предупреждения гиперреактивных осложнений (некротические реакции и др.). Ревак­цинацию проводят в возрасте 7, 12, 17, 22 и 27-30 лет лицам с отрицательной реакцией Манту.

(20) Спирохеты (семейство Spimchaetaceae [от греч. spe/ra, спираль, + chaite, волос]) относят к отделу Gracilicutes порядка Spirochactales. Спирохеты — тонкие, подвижные, спирально завитые бактерии длиной 3-500 мкм. В мазках располагаются одиночно либо образуют цепочки, объединённые внешней оболочкой. Клетки состоят из протоплазмати-ческого цилиндра, переплетённого с одной или более осевыми фибрил­лами, отходящими от субтерминальных прикрепительных дисков, рас­положенных на обоих концах цилиндра (что сближает их с простейши­ми). Медицинское значение имеют представители родов Тгеропета, Borrelia и Leptospira. Бактерии различных родов существенно различа­ются по тинкториальным свойствам; некоторые хорошо окрашиваются анилиновыми красителями (например, Borrelia recurrentis), другие тре­буют специальных методов окраски.