Электронпереносящий флавопротеин (ЭПФ - естественный акцептор электронов от девяти различных митохондриальных FAD-содержащих ацил-СоА- дегидрогеназ Для окисления восстановленных ацил-СоА-дегидрогеназ требуется 2 эквивалента флавопротеина, так как FAD, входящий в состав ЭПФ, в каталитическом цикле, по-видимому, принимает только один электрон
Дигидролипоамиддегидрогеназа
Фермент - гомодимер с мол. массой 51 кДа. Активный центр каждого мономера представлен центром связывания пиридиннуклео- тидов, молекулой FAD и в непосредственной близости к ней каталитически активным дисульфидом. Механизм реакции, катализируемый ДЛДГ, состоит в восстановлении дигидролипоамидом дисульфидной связи с последующим восстановлением FAD, который переносит гидрид-ион на окисленный NAD+. Эта реакция полностью обратима в отличие от суммарного окислительного декар- боксилирования, сопровождающегося необратимым окислением карбоксильной группы. Изолированная и очищенная ДЛДГ катализирует как восстановление NAD+ дигидролипоамидом, так и восстановление липоамида восстановленным нуклеотидом с соизмеримыми числами оборотов. Фермент можно отнести к основному генераторам АФК в митохондриях, катализирует NADH-зависимую аммоний-стимулируемую генерацию перекиси водорода. Не исключено, что токсичное и до сих пор малопонятное действие аммиака у млекопитающих может быть связано с повышением уровня АФК, образующихся при активации ДЛДГ.
Дыхательный комплекс I
Митохондриальная протон-транслоцирующая NADH:убихинон-окси- доредуктаза (комплекс I, первый пункт энергетического сопряжения, катализируют окисление NADH убихиноном, сопряжённое с трансмембранным переносом четырех протонов при окислении одной молекулы NADH и генерацией на сопрягающей мембране митохондрий разности электрохимических потенциалов ионов водорода (Др). NADH:убихинон-оксидоредуктазная реакция полностью обратима, если убихинон восстановлен какой-либо другой дегидрогеназой дыхательной цепи (например, сукцинатдегидрогеназой или мГФДГ), а сопрягающая мембрана энергизована. Потенциал-зависимый обратный перенос электронов в комплексе I в отсутствие NAD+ приводит к восстановлению кофакторов фермента и в аэробных условиях сопровождается генерацией АФК.
Этот еще мало понятый, сложный и совершенный ферментный комплекс (43 субъединицы у млекопитающих, семь из которых закодировано в мтДНК, несколько простетических групп, включая FMN и, по крайней мере, семь железосерных кластеров, а также несколько молекул CoQ, связанных с белками) является одноэлектронным донором, передающим электрон кислороду, и редокс-центром, локализованным перед участком, содержащим три различных связанных типа CoQ. Поскольку семь из 13 структурных генов в мтДНК кодируют полипептиды для Комплекса I, следовательно, Комплекс I с наибольшей вероятностью может подвергаться функциональным изменениям.
Комплекс I - чрезвычайно сложен: в митохондриях млекопитающих фермент построен, по крайней мере, из 44 различных субъединиц (мол. масса фермента составляет ~980 кДа). Ферменты из различных источников содержат сходные редокс-компоненты: FMN, 8-9 железо-серных кластеров и прочно-связанный убихинон. Функциональная роль дополнительных субъединиц фермента эукариот неизвестна.Комплекс I из различных источников имеет L-образную форму. Железо-серные центры фермента (обозначены на рисунке буквой N с порядковым номером выстроены в цепочку, обеспечивающую перенос электронов от восстановленного флавина к убихинон-связывающему центру. N1a может временно акцептировать электрон от FMN-радикала, возникающего при окислении восстановленного флавина одноэлектронным акцептором N3, такой механизм препятствует образованию АФК при нормальном функционировании фермента.
Комплекс I в наибольшей мере подвержен возрастным изменениям, что приводит к жесткому ограничению скорости электронного транспорта и, соответственно, к повышенной генерации активных форм кислорода. Помимо супероксид радикала, который под действием супероксиддисмутазы дисмутирует в пероксид водорода, из Н202 в присутствии двухвалентного железа образуется в высокоактивный радикал гидроксила •ОН.
Комплекс II
Комплекс II (сукцинатдегидрогеназа, сукцинат:убихинон-оксидо- редуктаза) локализован во внутренней мембране митохондрий. Трехмерные структуры комплекса II и гомологичной ему фумаратредуктазы прокариот известны. Ферменты состоят из 4 субъединиц. Гидрофильную часть комплекса II, расположенную в митохондриальном матриксе, образуют субъединица SDHA, содержащая ковалентно связанный FAD, и субъединица SDHB, в составе которой обнаружены 3 железо-серных центра. Субъединицы SDHC и SDHD гидрофобны и целиком погружены в мембрану. Они формируют центр связывания гема b (функция которого в катализе неизвестна) и центр связывания убихинона.
При низких концентрациях сукцината фумаратредуктаза в основном генерирует супероксид, а при повышении концентрации сукцината - Н2О2. Это позволяет думать, что образование супероксида происходит тогда, когда флавин может передать второй электрон расположенному рядом с ним железо-сер- ному центру [2Fe-2S]. Считают, что источником генерации в комплексе II служит флавин.
Комплекс III
Митохондриальная убихинол:цитохром с-оксидоредуктаза (комплекс III, b-c1 комплекс, второй пункт энергетического сопряжения) катализирует окисление убихинола цитохромом с, сопряженное с трансмембранным переносом двух ионов водорода и запасанием энергии в виде Δр. У прокариот эту реакцию катализирует минимальный набор из трех субъединиц, представленный цитохромом b, цитохромом с1 и железо-серным белком Риске. Митохондриальный комплекс III дополнительно содержит до 8 субъединиц, которые, по-видимому, выполняют структурную роль. В мембране фермент существует в виде гомодимера, связывающего только одну молекулу цитохрома с. Сердцевина каждого мономера образована гидрофобным полипептидом, несущим два гема b: низкопотенциальный (bL) и высокопотенциальный (bH), расположенные вблизи наружной и внутренней поверхностей мембраны, соответственно. Цитохром с1 и железо-серный кластер [2Fe-2S] (белок Риске) закреплены с помощью трансмембранных спиралей, а периферические домены этих белков локализованы в межмембранном пространстве. Белок Риске обеспечивает перекрестную связь между мономерами, так как его трансмембранная часть связана с одним мономером, а периферическая часть - с другим. Кроме того, белок Риске обладает конформационной подвижностью и занимает как минимум три дискретных положения, в которых его железо-сер- ный кластер расположен вблизи гема с1 (соположение) или вблизи гема bL (b-положение), или в промежуточном положении.
Механизм реакции, катализируемой комплексом III (протондви- жущий Q-цикл), состоящий из двух полу- реакций, схематично представлен на рисунке на слайде.
На первой стадии реакции происходит окисление убихинола в центре Q сопровождающееся разветвлением путей переноса двух электронов: один электрон восстанавливает железо-серный кластер белка Риске (реакция 1), а другой электрон переносится на гем bL (реакция 2). Окисление убихинола приводит к высвобождению двух протонов в межмембранное пространство. Электрон с железо-серного кластера последовательно переносится на цитохромы с1 и с (конечный акцептор) (реакции 3 и 4, соответственно), а восстановленный гем bL передает электрон гему b расположенному на противоположной стороне мембраны (электрогенная стадия катализа) вблизи второго убихинон- связывающего центра Q; (реакция 5). В центре Q; происходит окисление гема ЬН убихиноном и образование убисемихинона (реакция 6а). Обсуждают два возможных механизма разделения путей переноса электронов в центре Qo. Реакции 1 и 2 могут протекать последовательно; в этом случае образуется свободный радикал убисемихинона в центре Qo. Альтернативный механизм - синхронное окисление убихинола белком Риске и гемом bL без образования убисемихинона. Во второй полуреакции в центре Qo окисляется убихинол, и повторяются реакции 1-5. Находящийся в центре Q; убисемихинон восстанавливается гемом ЬН (реакция 6б, сопровождающаяся захватом двух протонов из митохондриального матрикса). В конечном итоге происходит окисление одной молекулы убихинола двумя цитохромами с, трансмембранный перенос двух протонов из матрикса в межмембранное пространство и выделение двух стехиометрических (скалярных) протонов, так как убихинол - донор атомов водорода, а цитохром с акцептирует только электроны.
Убихинол:цитохром с-редуктазная реакция полностью обратима, поэтому в комплексе III существуют специальные механизмы, предотвращающие протекание некоторых реакций Q-цикла в «нежелательном» направлении. Обязательное раздвоение потоков электронов в центре Q необходимое для протон-трансло- цирующей активности комплекса III, может достигаться запретом одновременного присутствия в центре Qo отрицательно заряженного убисемихинона и восстановленного гема b а также перемещением каталитического домена железо-серного белка Риске из b-положения в положение с1.
Центром генерации супероксида в комплексе III считают убисе- михинон, образующийся в центре Qo. Скорость образования супероксида комплексом III в отсутствие ингибиторов незначительна по сравнению, например, с генерацией супероксида комплексом I. Комплекс III образует супероксид по обе стороны мембраны в равных долях.
