Репарация. Самый простой способ

Вернемся для начала к фотореактивации. Это один из частных примеров механизма реактивации, или прямого восстановления, при котором поврежденное звено ДНК превращается в нормальное без каких-то промежуточных шагов. В случае фотореактивации происходит вот что. Под влиянием ультрафиолетового света соседние основания тимина в ДНК могут сшиваться друг с другом и образовывать так называемые циклобутановыепиримидиновые димеры, которые очень сильно искажают структуру ДНК и не дают возможности ДНК-полимеразам копировать поврежденный участок. Бактерии же содержат фермент фотолиазу, который использует энергию видимого света для того, чтобы расщепить связи между основаниями в димере, превращая его опять в два тимина (рис. 1).

Рис. 1. Реакция, катализируемая фотолиазой. Фотон с длиной волны, соответствующей синему цвету, поглощается ферментом, и его энергия (h ν) используется для расщепления тиминового димера на отдельные тимины

С исследования фотолиазы началась карьера Азиза Санджара. Нет, он не открыл ее — это сделал еще в конце 1950-х годов Стэн Руперт (Claud S. (Stan) Rupert), в лабораторию которого спустя полтора десятка лет приехал молодой выпускник Стамбульского университета. Санджар впервые клонировал фотолиазу, то есть выделил кодирующий ее ген, а потом произвел генно-инженерный белок. Природной фотолиазы в бактериях очень мало, и работа эта стала переломной для исследования фотореактивации — теперь можно было производить белок в больших количествах и изучать его всесторонне, чем Санджар активно и долго занимался. Химики часто протестуют, когда премии в области химии дают биологам. Но надо сказать, что фотолиаза представляет собой прекрасный пример сложной химической системы, осуществляющейфотокатализ: путь энергии, принесенной фотоном, поглощенным 5,10-метенилтетрагидроптероилполиглутаматом — хромофором в составе белка — через второй хромофор (флавинадениндинуклеотид) к циклобутановому пиримидиновому димеру сейчас прослежен вплоть до квантовомеханического описания.

Вырезать и заменить

Достаточно ли этого для получения Нобелевской премии? Кто знает. Но Азиз Санджар не ограничился фотолиазой и занялся еще и другим малопонятным на тот момент явлением, которое тогда называли «темновой репарацией». На самом деле бактерии, облученные ультрафиолетом, способны исправлять внесенные повреждения не только на свету — просто для этого нужно гораздо больше времени. Фотолиаза тут почти ни при чем («почти» — потому что, как выяснилось гораздо позже, она помогает темновой репарации, но без нее вполне можно обойтись), работают другие ферменты.

К тому времени было известно, что в темноте тиминовые димеры постепенно исчезают из ДНК (это открытие сделал в начале 1960-х годов Ричард Сетлоу (Richard B. Setlow), который вполне мог бы претендовать на премию, если бы не умер в апреле этого года) и что после облучения ультрафиолетом в клетках начинается синтез ДНК (автор этого открытия Филип Ханаволт (Philip Hanawalt) еще жив и в свои 84 года активно работает, но премия его обошла). Были известны три гена, которые отвечали за темновую репарацию, их назвали uvrA, uvrB и uvrC (uvr — от английского «UV-resistant», устойчивый к ультрафиолету), но оставалось совершенно непонятно, как же всё это в клетке происходит. Опять же, в основном проблемы были в том, что белков этих в клетке очень мало, и исследовать их из-за этого очень трудно.

Санджар, занявшись этим вопросом, для начала изобрел совершенно фантастический метод бактериальных «макси-клеток», который позволял получать огромный избыток нужного продукта при минимальном загрязнении другими клеточными белками. На рубеже 1970–80-х годов им пользовались десятки лабораторий для идентификации самых разных белков, а сам изобретатель с его помощью быстро охарактеризовал белковые продукты генов uvrA, uvrB и uvrC и показал, что они образуют комплекс, который назвали эксцинуклеазой (Excinuclease) — он был способен вырезать (англ. excise) кусок ДНК размером 13 пар нуклеотидов вокруг тиминового димера. От этого весь механизм получил название эксцизионной репарации нуклеотидов (Nucleotide excision repair, NER; рис. 2). Дальнейшие исследования позволили установить, что после вырезания фрагмента, содержащего повреждение, ДНК-полимераза синтезирует нормальный участок цепи ДНК, и процесс репарации завершается ферментом ДНК-лигазой, которая восстанавливает целостность остова ДНК.

Рис. 2. Эксцизионная репарация нуклеотидов. Эксцинуклеаза UvrABC вырезает короткий участок ДНК вокруг повреждения, геликаза UvrD его вытесняет, и образовавшаяся брешь застраивается ДНК-полимеразой

Как выяснилось впоследствии, эксцизионная репарация нуклеотидов для жизни в целом гораздо важнее, чем фотореактивация. Например, у человека фотолиазы нет — из всех млекопитающих ее сохранили только сумчатые, а у остальных сохранились гомологи фотолиазы, криптохромы, отвечающие за суточные ритмы (и тоже открытые Санджаром). Поэтому вся репарация вызванных ультрафиолетовым светом повреждений у нас опирается исключительно на эксцизионную репарацию нуклеотидов. Правда, белки этой системы у нас совсем не похожи на бактериальные, но принцип работы тот же — вырезать отрезок ДНК и заменить его новым. Дефекты эксцизионной репарации нуклеотидов вызывают тяжелейшее наследственное заболевание —пигментную ксеродерму, при которой малейшее пребывание на солнце приводит к ожогам, и за несколько лет жизни развивается рак кожи. Да что там кожи: для пигментной ксеродермы очень характерен рак кончика языка — человек на свету облизывает пересохшие губы, и этих нескольких секунд облучения достаточно, чтобы в ДНК возникло столько повреждений, что они в отсутствие репарации вызывают мутации и рак. Еще более важно то, что фотореактивация — процесс специфичный только для тиминовых димеров, другие повреждения ею не исправляются, а вот эксцизионная репарация нуклеотидов универсальна и помогает бороться с огромным числом самых разнообразных повреждений ДНК, например с теми, что вызываются канцерогенами в табачном дыме.

Воздав такую хвалу эксцизионной репарации нуклеотидов, нужно сразу отметить, что исправляет она от силы 10% всех повреждений, возникающих в нашей ДНК. Остальное находится в ведении систем, открытых двумя другими лауреатами. Принцип действия у них также основан на удалении поврежденной части ДНК и ее повторном синтезе, но вот механизмы отличаются довольно сильно.