Репарация однонитевых разрывов ДНК. Еще один тип реакций прямой репарации был обнаружен для однонитевых разрывов ДНК, индуцируемых, например, ионизирующим излучением. При этом с помощью фермента ДНК полинуклеотидлигазы (от англ. ligase - соединять, связывать) происходит прямое воссоединение разорванных концов в молекуле ДНК.
Репарация АП-сайтов за счет прямой вставки пуринов. Голландский ученый Т. Линдал в 1979 году нашел, что при некоторых типах повреждений пуриновых оснований ковалентная связь между основанием и сахаром (гликозидная связь) может рваться. Тогда в молекуле ДНК на месте этих оснований образуется брешь, названная АП-сайтом. Термин приложим также к случаям, когда из ДНК выпадают пиримидиновые основания (термин АП-сайт, таким образом, объединяет все случаи выщепления оснований с образованием и апуриновых и апиримидиновых сайтов). Описаны ферменты, названные инсертазами (от англ. insert - вставлять), которые могут вставлять в брешь такое же основание, какое было до поражения, и соединять его с сахаром. Структура ДНК приобретает исходный неповрежденный вид.
Эксцизионная репарация. Существуют более сложные реакции восстановления, напоминающие хирургические вмешательства в структуру ДНК, когда поврежденные участки вырезаются из цепи ДНК (отсюда происходит и термин "эксцизионная репарация", от англ. excision - вырезание), а затем образовавшиеся бреши заполняются неповрежденным материалом.
А. Вырезание поврежденных оснований гликозилазами и застройка АП-сайтов. К настоящему времени описано много типов ферментов-гликозилаз, каждый из которых узнает разнообразные поврежденные основания (такие, как метилированные, окисленные, восстановленные, дезаминированные основания, основания, связанные с формамидными группировками, и т.п., табл. 1). Гликозилазы присоединяются к ним, рвут гликозидные связи между модифицированным основанием и сахаром дезоксирибозой, за счет чего образуются АП-сайты. АП-сайт распознается теперь другим ферментом, АП-эндонуклеазой. Последние найдены у бактерий, растений, животных, включая человека. Как только в нити ДНК возникает разрыв, в работу вступает еще один фермент - фосфодиэстераза: он отщепляет от ДНК ту сахарофосфатную группу, к которой теперь не присоединено основание. Появляется брешь в одной цепи ДНК размером в один нуклеотид. Напротив бреши в противоположной нити ДНК расположен неповрежденный нуклеотид, и следующий фермент - ДНК полимераза I вставляет в брешь комплементарный ему нуклеотид, присоединяя его к свободному 3'ОН-концу. Чтобы соединить два свободных конца (3'ОН-конец вставленного нуклеотида и 5'-конец, ранее образовавшийся при разрыве нити ДНК АП-эндонуклеазой), вступает в действие еще один фермент - полинуклеотидлигаза. Теперь вся структура ДНК полностью восстановлена: неправильное основание удалено, сахарофосфат, к которому это основание было прикреплено, вырезан из нити ДНК, брешь заполнена правильным нуклеотидом, и все однонитевые разрывы залечены. Поскольку последовательность реакций запущена в действие путем расщепления гликозидной связи, этот вид репарации получил название "вырезание оснований с помощью гликозилаз".
Б. Вырезание нуклеотидов. Другим типом эксцизионной репарации является более сложная и энергетически более дорогая реакция вырезания не просто поврежденного основания, а значительного участка цепи ДНК перед и позади повреждения (рис. 1). Эту реакцию в клетках E. coli выполняет мультиферментный комплекс, содержащий эндонуклеазы, кодируемые тремя генами: uvrA, uvrB и uvrC (названия генов даны по первым буквам слов ultra violet repair). Комплекс получил название "эксинуклеаза".
Процесс был обнаружен в клетках человека в лаборатории Р. Сетлоу в США и в моей группе (В. Сойфер, Н. Яковлева-Сойфер и А. Мустафина) в 1970 году. Поиск эксцизионной репарации у растений оказался более трудным. Сначала американцы Дж. Троско и Э. Мансур не смогли ее обнаружить и в 1969-1973 годах заявили, что высшие растения либо не получили в ходе эволюции этот важный механизм, либо в ходе той же эволюции утеряли его. Однако в 1973-1978 годах в моей лаборатории, когда я еще работал в Москве, эксцизионная репарация у растений была найдена, а затем изучены процессы повреждения ДНК растений облучением и алкилированием. Было показано, что подавление репарации ведет к резкому увеличению числа мутаций хромосом, замедлению роста и развития растений и к другим нежелательным последствиям. В последние годы эксцизионную репарацию интенсивно исследовали ученые многих стран мира. В частности, было показано, что человеку требуется в среднем в четыре раза больше ферментов репарации, чем бактериям (эксинуклеаза состоит по крайней мере из 17 белков, застройка бреши идет с участием ДНК полимераз s или e), а вырезаемый из поврежденной ДНК кусок имеет длину не 12, а 29 нуклеотидов и т.д.
Репарация неспаренных оснований. Довольно часто (у E. coli один раз на 10 тыс. пар нуклеотидов, у эукариотов еще чаще) во время репликации ДНК происходят ошибки спаривания, в результате которых вместо комплементарной пары нуклеотидов А + Т или Г + Ц в дочернюю цепь ДНК оказываются включенными нуклеотиды, некомплементарные нуклеотидам в материнской нити (их называют мисмэтчами - от англ. mismatch). Однако ДНК полимеразы обладают следующим свойством: после подстановки очередного нуклеотида в растущую нить ДНК (полимеразный комплекс движется в направлении от 5'-конца синтезируемой нити к 3'-OH-концу) делать шаг назад (в направлении от 3' к 5') и вырезать последний нуклеотид, если он некомплементарен нуклеотиду в матричной нити ДНК. Этот процесс исправления ошибок спаривания, или коррекции, иногда не срабатывает, и тогда в ДНК по окончании репликации остаются невырезанными некоторые неправильные пары, остаются мисмэтчи. Для их устранения клетки живых организмов обладают специально созданной Природой системой репарации.
При неправильном спаривании, в отличие от всех описанных выше случаев репарации модифицированных или поврежденных оснований и нуклеотидов, в структуре ДНК не появляется необычных оснований, неправилен лишь характер спаривания. Как же клетка в таком случае ухитряется распознать неправильность и начать репарацию? Ясно, что неправильное спаривание (ошибка репликации) может затронуть только дочернюю нить ДНК; матричная нить в процессе репликации остается неизменной (если в матричной нити появилось повреждение и не было исправлено с помощью репарации, то это и есть мутация, и она будет воспроизводиться при репликации во всех последующих поколениях). Следовательно, система репарации мисмэтчей должна оперировать на дочерней нити и производить замену некомплементарных оснований только в ней. Клетки при этом используют важное различие в структуре матричной и дочерней нитей, найденное в 70-х годах. Оказалось, что вскоре после окончания репликации специальные ферменты - метилазы присоединяют метильные группы к аденинам в последовательностях ГАТЦ. Поэтому во время следующего раунда репликации нити ДНК оказываются различимыми: материнская нить ДНК несет метилированные аденины, а в дочерней нити до окончания репликации аденины еще неметилированы. Их метилирование начнется только по окончании репликации. Пока они остаются неметилированными, клетки должны успеть отрепарировать мисмэтчи.
В кишечной палочке этот процесс идет под контролем продуктов четырех генов: MutH, MutL, MutS и MutU (MutU, как было выяснено позже, есть не что иное, как ген UvrD, или хеликаза II). Процесс начинается с того, что к некомплементарной паре мисмэтча присоединяется белок mutS. С ним тут же связываются белок mutL и две молекулы белков mutH. Каждый из белков mutH распознает участок ГАТЦ и обладает эндонуклеазной активностью, с помощью которой ДНК в этой последовательности может быть надрезана вблизи аденина в неметилированной нити. Надрезы могут быть внесены как в 5'-, так и в 3'-положение относительно аденина. Мультимолекулярный комплекс, составленный из этих белков, массивен и связывает длинный фрагмент ДНК. Последний протягивается через комплекс до тех пор, пока два участка ГАТЦ, расположенные по обе стороны от мисмэтча, удерживаемого белком mutS, не окажутся захваченными молекулами белков mutH. Иногда расстояние между участками ГАТЦ может превышать несколько тысяч нуклеотидов. Каждый из белков mutH распознает участок ГАТЦ и разрывает дочернюю нить около неметилированных аденинов. Если такой надрез сделан с 5'-стороны от аденина (справа на рис. 2), к нему присоединится еще один белок - экзонуклеаза, которая расщепит нити ДНК в направлении 5' 3'. Этот белок начнет свою работу, разрушит всю дочернюю нить ДНК до места неправильного спаривания и даже пройдет несколько дальше. Если же первичный надрез будет сделан эндонуклеазой, оперирующей в содружестве с mutH белком, расположенным с 3'-стороны мисмэтча (слева на рис. 2), то потребуется другая экзонуклеаза, двигающаяся по ДНК в направлении 3' 5'. Ее работа будет продолжаться до тех пор, пока не будет устранен участок мисмэтча. Затем как в случае с 5' 3'-, так и с 3' 5'-экзонуклеазой бреши должны быть застроены ДНК-полимеразой, а концы воссоединены с помощью лигаз. Разумеется, для высвобождения концов нитей после внесения первичных разрезов молекула ДНК должна быть расплетена (требуется белок хеликаза), нужны также источники энергии в виде АТФ, а для застройки брешей требуются дезоксирибонуклеотидтрифосфаты. Процесс обнаружен в клетках человека, дрожжей и некоторых других организмов.
Пострепликативная, или рекомбинационная, репарация. В 1968 году американцы У. Рапп и П. Ховард-Фландерс исследовали облученные УФ-светом бактерии, у которых были повреждены гены, ответственные за синтез эксинуклеаз. В результате эксцизионная репарация стала невозможной. Поскольку опыты проводили в темноте, то и фотореактивация не могла осуществиться. В этих клетках матричная ДНК содержала много невырезанных димеров тимина, и в момент, когда ДНК полимераза, ведущая репликацию, доходила до первого из них, она буквально застывала на этой точке. Спустя 10 секунд ДНК полимераза ухитрялась каким-то образом перебраться за димер тимина и возобновляла синтез позади дефекта, пока снова не "натыкалась" на димер. В результате формировалась дочерняя ДНК с брешами напротив повреждения. Сейчас мы знаем, что репликацию ДНК осуществляет не один лишь фермент ДНК полимераза III, но комплекс из нескольких десятков белков. Как они могут перебираться через повреждение - не до конца разгаданная загадка. Как тот же комплекс может возобновлять реакцию репликации без помощи затравки (короткого участка РНК, без которого синтез ДНК невозможен) - также неясно. Но обнаруженный Раппом и Ховардом-Фландерсом факт задержки синтеза никто не оспаривает. Сама же задержка на 10 секунд весьма значительна, так как репликация у кишечной палочки идет со скоростью 1000 нуклеотидов в 1 секунду. Таким образом, участок дочерней нити, иногда длиной в несколько генов, оказывается неудвоенным при синтезе ДНК, причем в зоне напротив бреши (в матричной цепи) так и остается незалеченным дефект, и это может привести клетку к гибели. Чтобы его залечить, клетка прибегает к приему, похожему на рекомбинацию (рис. 3). Из комплементарной нити матричной ДНК (она была свободна от дефектов), на которой репликация ДНК уже завершена, с помощью белка recA вырезается участок ДНК, равный по длине участку бреши и встраивается в брешь. Затем лигазы соединяют концы вставленного фрагмента с концами нормально синтезированного участка дочерней нити. После этого другие ферменты репарации устраняют дефект в исходно поврежденной нити и ДНК становится залеченной. Одновременно брешь, оставшаяся после вырезания участка из материнской нити, застраивается ДНК полимеразой I и концы соединяются лигазой.
SOS-репарация. Что случится, если клетка подошла к моменту, когда нужно реплицировать ДНК, но в ней остались повреждения, которые ни одна из описанных выше систем репарации не смогла устранить? Репликация застопорится на первом же неустраненном поражении, и если их в ДНК много, клетка должна погибнуть. В этих условиях в клетках активируется еще один крайне рискованный механизм репарации, обнаруженный впервые в 1974 году югославским ученым Мирославом Радманом, эмигрировавшим во Францию. Радман установил, что при этом индуцируется синтез белков, которые присоединяются к ДНК полимеразному комплексу, "загрубляют" его работу, и такой "подпорченный" комплекс становится способным строить дочернюю ДНК напротив дефектных звеньев матричной нити, но, разумеется, в дочерней нити теперь появляется довольно много ошибок, мутаций. Радман остроумно назвал этот механизм "SOS-репарация" от международно признанного сигнала бедствия SOS (спасите наши души). Принцип метода пояснен на рис. 4. В результате SOS-репарации клетка спасается от гибели на этом этапе: ее ДНК оказывается удвоенной, хотя и с ошибками, и теперь может произойти клеточное деление, но если жизненно важные функции все-таки безнадежно испорчены, такая клетка все равно погибнет позже из-за неспособности правильно функционировать. Если же возникшие мутации не окажут летального действия, клетка худо-бедно, но проживет и ее потомки будут нести уже теперь всегда наследственную память о пережитых некогда последствиях мутационной катастрофы. Конечный исход читатель может дорисовать в своем воображении сам, так же как легко может себе представить, чем обернется устойчивое загрязнение среды обитания для любых организмов, включая человека, если им придется все чаще и чаще прибегать к индуцированному загрязнениями ответу типа SOS-репарации.
РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ РЕПАРИРУЮЩИХ СИСТЕМ В ЖИВОМ МИРЕ
Фотореактивация, как мы уже знаем, была обнаружена одновременно у прокариотов (бактерий и вирусов) и эукариотов (дрожжей). Однако более сложные реакции сначала не были найдены в клетках млекопитающих, и в особенности у человека. Начался долгий процесс поиска методов биохимических исследований, которые помогли бы найти разнообразные механизмы репарации в мире живых существ. В табл. 2 дано сегодняшнее представление о распространенности способов восстановления дефектов в ДНК у различных типов организмов. Надо подчеркнуть, что исследования в этой области идут интенсивно во всем мире. В 1994 году редакция одного из самых авторитетных научных журналов - "Science" ("Наука"), по традиции посвящающая каждый год предпоследний выпуск журнала самому важному событию в науке за этот год, посвятила его репарации ДНК. Этот выбор был связан с тем, что именно в том году было окончательно доказано увеличение частоты раковых заболеваний от подавления мисмэтч-репарации.
ДЕФЕКТЫ РЕПАРАЦИОННЫХ СИСТЕМ
И НАСЛЕДСТВЕННЫЕ БОЛЕЗНИ
В 1968 году Джеймс Кливер нашел причину коварной и неизлечимой болезни человека - пигментной ксеродермии. У носителей болезни под действием обычного солнечного света, в котором всегда присутствуют УФ-лучи, на коже возникают сначала красные пятна, которые постепенно переходят в незарастающую коросту, чаще всего трансформирующуюся в раковые опухоли (рис. 5). Кливер нашел, что первопричиной этого заболевания служат дефекты разных репарирующих систем. Многочисленные исследования выявили варианты болезни, обусловленные дефектами всевозможных систем репарации. В настоящее время известно, что многие другие наследственные болезни человека обязаны своим возникновением повреждениям отдельных этапов различных процессов репарации. Список этих болезней, пополняемый все новыми примерами, приведен в табл. 3.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Открытие и детальное изучение процессов репарации ДНК стало одним из интереснейших и важных достижений молекулярной генетики второй половины ХХ века. Аргументом в пользу решающей роли процессов репарации в эволюции жизни на Земле стали эксперименты американского ученого Артура Корнберга. Долгое время он, первооткрыватель ДНК полимераз, пытался осуществить в пробирке искусственный синтез ДНК, но это ему не удавалось. Вместо линейных полимеров он получал разветвленные (и нежизнеспособные) молекулы ДНК. И только когда в середине 70-х годов он ввел в реакционную смесь ферменты репарации, то добился успеха: начали синтезироваться нормальные двунитевые молекулы ДНК, без ветвящихся сахарофосфатных нитей и других дефектов. После этого стали думать, что и в природе эволюция первых клеток без ферментов репарации произойти не могла. Так ли это было на самом деле, могут установить только специально спланированные опыты по воссозданию жизни в условиях лаборатории, однако пока это задача будущего.
Рис. 1-3 воспроизведены с разрешения издательства в модифицированном виде из кн.: Snustad P., Simmons M., Jenkins J. Principles of Genetics. John Willey and Sons, Inc., 1997. Рис. 4 воспроизведен с изменениями из кн.: Weaver F., Hedrick P.W. Principles of Genetics. 3 ed., 1993, с разрешения издателя. Остальные рисунки воспроизведены с разрешения авторов и издательства из кн.: Friedberg E., Walker G., Siede W. DNA Repair and Mutagenesis. Wash. (D.C.): ASM Press, 1995. Автор выражает признательность всем авторам и издательствам, любезно разрешившим использовать их иллюстрации.
* * *
Валерий Николаевич Сойфер, доктор физико-математических наук, профессор Университета им. Джорджа Мейсона и директор Лаборатории молекулярной генетики этого университета, расположенного в пригороде Вашингтона (США), академик Нью-Йоркской академии наук, иностранный член Национальной академии наук Украины, Российской академии естественных наук, почетный доктор Казанского и Иерусалимского университетов, председатель Правления Международной Соросовской Программы Образования в Области Точных наук и ее генеральный директор, награжден Международной медалью Грегора Менделя за достижения в области биологических наук. Основной круг научных интересов - изучение структуры и функционирования ДНК, репарации, молекулярных последствий загрязнения окружающей среды, истории науки. Автор 18 книг и более 200 научных работ.
Выполнила:
студент группы ОМ-109 Б
Брюшинина Евгения
Проверила:
Ермекова С.А
Алматы 2012
Содержание
Введение……………………………………………………………………………………………..3
Понятие репарации………………………………………………………………………………….3
История открытия…………………………………………………………………………………...3
Источники повреждения ДНК……………………………………………………………………..4
Основные типы повреждений……………………………………………………………………..4
Устройство системы репарации…………………………………………………………………...4
Типы репарации…………………………………………………………………………………….4
Прямая репарация…………………………………………………………………………………..6
Фотореактивация …………………………………………………………………………………..6
Эксцизионная репарация…………………………………………………………………………..7
Мисмэтч-репарация………………………………………………………………………………...8
SOS-репарация……………………………………………………………………………………...9
Интересные факты………………………………………………………………………………….10
Заключение………………………………………………………………………………………….10
Использованные источники……………………………………………………………………….12
Введение
Видимо, уже на ранних стадиях эволюции ДНК заменила РНК в качестве носителя генетической информации. Этому гипотетическому событию должны были способствовать большая химическая устойчивость ДНК, связанная с заменой рибозы на дезоксирибозу, и двуцепочечное строение, «скрывающее» целый ряд реакционноспособных группировок. Но несмотря на свои «преимущества», ДНК постоянно подвергается химическим изменениям, как спонтанным, так и индуцируемым мутагенами и даже клеточными метаболитами. Еще одна обычная причина повреждений ДНК – радиация и ультрафиолетовое облучение. Большинство происходящих с ДНК изменений недопустимы: они либо приводят к вредным мутациям, либо блокирую репликацию ДНК и вызывают гибель клеток. Поэтому все клетки имеют специальные системы исправления повреждений, репарации ДНК. Нарушение этих систем губительно. Репарация УФ повреждений ДНК нарушена у людей, страдающих тяжелым наследственным заболеванием – пигментной ксеродермой. Такие больные не могут бывать на солнце и обычно умирают в раннем возрасте от какого-либо злокачественного заболевания.
Принципы репарации ДНК у различных организмов сходны, поэтому эти принципы рассматриваются на примере E. coli, у которой они хорошо изучены.
ПОНЯТИЕ РЕПАРАЦИИ
Репарация — особая функция клеток, заключающаяся в способности исправлять химические повреждения и разрывы в молекулах ДНК, повреждённой при нормальном биосинтезе ДНК в клетке или в результате воздействия физическими или химическими агентами. Осуществляется специальными ферментными системами клетки.
История открытия
Начало изучению репарации было положено работами А. Келнера (США), который в 1948 обнаружил явление фотореактивации (ФР) — уменьшение повреждения биологических объектов, вызываемого ультрафиолетовыми (УФ) лучами, при последующем воздействии ярким видимым светом (световая репарация).
Р. Сетлоу, К. Руперт (США) и др. вскоре установили, что фотореактивация — фотохимический процесс, протекающий с участием специального фермента и приводящий к расщеплению димеров тимина, образовавшихся в ДНК при поглощении УФ-кванта.
Позднее при изучении генетического контроля чувствительности бактерий к УФ-свету и ионизирующим излучениям была обнаружена темновая репарация — свойство клеток ликвидировать повреждения в ДНК без участия видимого света. Механизм темновой репарации облученных УФ-светом бактериальных клетокбыл предсказан А. П. Говард-Фландерсом и экспериментально подтвержден в 1964 Ф. Ханавальтом и Д. Петиджоном (США). Было показано, что у бактерий после облучения происходит вырезание поврежденных участков ДНК с измененными нуклеотидами и ресинтез ДНК в образовавшихся пробелах.
Системы репарации существуют не только у микроорганизмов, но также в клетках животных и человека, у которых они изучаются на культурах тканей. Известен наследственный недуг человека — пигментная ксеродерма, при котором нарушена репарация.
Источники повреждения ДНК
* УФ излучение
* Радиация
* Химические вещества
* Ошибки репликации ДНК
* Апуринизация — отщепление азотистых оснований от сахарофосфатного остова
* Дезаминирование — отщепление аминогруппы от азотистого основания
Основные типы повреждений ДНК
* УФ излучение
* Радиация
* Химические вещества
* Ошибки репликации ДНК
* Апуринизация — отщепление азотистых оснований от сахарофосфатного остова
* Дезаминирование — отщепление аминогруппы от азотистого основания
Устройство системы репарации
Каждая из систем репарации включает следующие компоненты:
* фермент, "узнающий" химически изменённые участки в цепи ДНК и осуществляющий разрыв цепи вблизи от повреждения;
* фермент, удаляющий повреждённый участок
* фермент (ДНК-полимераза), синтезирующий соответствующий участок цепи ДНК взамен удалённого;
* фермент (ДНК-лигаза), замыкающий последнюю связь в полимерной цепи и тем самым восстанавливающий её непрерывность (см. рис. справа).
ТИПЫ РЕПАРАЦИИ
По отношению к процессу репликации различают два типа репарации ДНК:
1. Дорепликативную (включающую фотореактивационную и эксцизионную формы, направленные на вырезание поврежденных участков ДНК);
2. Пострепликативную (осуществляемую с помощью механизмов, участвующих в процессах рекомбинации и репликации ДНК).
Репарация может осуществляться как конститутивно с помощью специфического набора ферментов, постоянно присутствующих в нормально функционирующих клетках (фотореактивационная, эксцизионная и пострепликативная), так и в ответ на повреждение ДНК или прекращение ее синтеза (путем активации группы генов, контролирующих различные клеточные функции, так называемая SOS-репарация).
У бактерий имеются по крайней мере 2 ферментные системы, ведущие репарацию — прямая и эксцизионная.
Типы репарации ДНК:
* Прямое исправление повреждений
Наиболее частая причина точечных мутаций у человека: это спонтанное добавление метильной группы — один из типов алкилирования. Такие модификации исправляются без разрушения цепи ДНК ферментами — гликозилазами. Фермент О-6-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераз (MGMT) защищает клетку от токсических эффектов, производимых алкилирующими агентами, переводя для этого метильную группу из О-6-метилгуанин-ДНК в цистеиновый остаток в MGMT.
* Починка путем вырезания основания (эксцизионной репарации основания — BER)
Главные способы, посредством которых происходит починка оснований ДНК, включают устранение поврежденного основания, которое осуществляют ферменты нуклеазы. Возникающая лакуна может быть заполнена ДНК-полимеразой, что сопровождается лигацией с родительской ДНК. Окислительные повреждения, как основные, так и индуцированные, являются важными причинами для починки оснований ДНК.
* Починка путем вырезания нуклеотида (эксцизионной репарации нуклеотида — NER)
Система NER обеспечивает способность клетки устранять объемные повреждения в ДНК. NER удаляет содержащий повреждение олигонуклеотид из ДНК посредством распознавания повреждения, разреза, вырезания, нового повторного синтеза и лигации. ДНК-полимеразы (у эукариот их известно более 15) различаются по ряду признаков, в том числе по количеству нуклеотидов, которые они могут встроить в растущую цепь за один акт связывания с дуплексом ДНК. присоединяют один нуклеотид, а при участии белка l и bДНК-полимеразы —e иdPCNA (proliferating cell nuclear antigen) ДНК-полимеразы способны вставить фрагмент необходимой длины. Повреждения ДНК в активно транскрибирующих генах, особенно в транскрибирующей спирали, чинятся в первую очередь и потому быстрее, чем повреждения ДНК в остальной части генома. Так клетка защищает целостность процесса транскрипции.
* Репарация ошибок спаривания — мисмэтч репарация (mismatch — MMR)
Этот метод исправляет ошибочно встроенные неповрежденные основания, которые не образуют нормальное Уотсон-Криковское спаривание (A • T, C • G). Такие ошибки иногда происходят при репликации с помощью ДНК- полимеразы. В MMR участвуют ферменты, вовлеченные в BER и NER, а также специализированные ферменты. Синтез ДНК при MMR осуществляется ДНК-полимеразами
* Гомологичная рекомбинация
У эукариот существует два основных способа устранить двухцепочечные разрывы: гомологичная рекомбинация (рекомбинационная репарация) и соединение негомологичных концов. Прямое соединение сломанных концов требует специальных ферментов, которые узнают и связывают разорванные концы с последующим их сшиванием. Починка разрывов двойной спирали (и разрывов одной спирали) обычно включает в себя продуцирование трехконечного односпирального хвоста с помощью экзонуклеаз или геликаз. Посредством инвазии спирали, при которой односпиральный хвост вторгается в неповрежденную гомологичную молекулу ДНК, синтезируется ДНК. Одновременно образуется так называемое холлидеевское сочленение в комплексе ДНК. Через промежуток этого сочленения проводятся две молекулы ДНК (как со структуральным перекрестом, так и без него), каждая из которых более не содержит разрывов.
* Негомологичное соединение концов—NHEJ (Nonhomologous End-Joining)
Если разорванная ДНК имеет тупые концы, и соединение двух фрагментов ДНК происходит случайно, то такая репарация называется NHEJ. Главным компонентом NHEJ восстановительного комплекса является зависящий от ДНК белок киназа (DNA-PK), или белок Ku — гетеродимерная субъединица, состоящая из двух белков Ku70 и Ku80. Этот белок служит для выравнивания концов разорванной ДНК, чтобы упростить процесс их склеивания или выступает в качестве сигнальной молекулы для мобилизации других восстанавливающих белков.
Рассмотрим подробнее некоторые из вышеперечисленных типов.
Прямая репарация ДНК
Прямая репарация ДНК обеспечивает прямое восстановление исходной структуры ДНК или удаление повреждения. Широко распространенная система репарации такого рода — фотореактивация пиримидиновых димеров. Кроме нее, к этому типу относятся: репарация ДНК за счет 3'-5'-экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы, репарация одноцепочечных разрывов ДНК с помощью полинуклеотиллигазы, а также генетическая репарация повреждений, вызванных алкильными или метильными группами, путем удаления этих групп специфическими ферментами.
Фотореактивация
В 1949 г. А. Кельнер и в 1950 г. Р. Дульбекко установили, что жизнеспособность актиномицетов и бактерий, подвергнутых УФ-облучению в летальных дозах, восстанавливается, если затем воздействовать на них видимым светом. Явление было названо фотореактивацией. Эффективность ее зависит от уровня рН, температуры и физиологического состояния клетки. Восстановительный эффект при фотореактивации (рис.) связан с действием фермента — дезоксирибозидпиримидинфотолиазы, представляющего собой полипептид, ассоциированный для его активности с небольшой молекулой РНК (10-15 нуклеотидов).
Этот фермент расщепляет димеры двух соседних пиримидинов циклобутанового типа в одной цепи ДНК, образующиеся под влиянием УФ-лучей, действие которых подробнее рассмотрено в нашей статье. Каждый из димеров задерживает репликацию примерно на 10 секунд. Фермент присоединяется к ним и в темноте, и на свету, но реакция расщепления связей, объединяющих две молекулы пиримидинов, энергетически зависит от действия видимого света с большей длиной волны. На свету пиримидиновые димеры расщепляются, за счет разрыва ковалентных связей происходит мономеризация и таким образом восстанавливается нативная структура ДНК. К эффективному диапазону (365-490 нм) относятся наиболее длинноволновые УФ-лучи (365-390 нм) и примыкающие к ним видимые синие лучи (435—495 нм). Наибольшая эффективность фотореактивации отмечена для голубой части видимого спектра. Если же необходимо исключить возможность реактивации, то опыты следует проводить в более длинноволновой части спектра, начиная с желтого света (570-590 нм).
За 1 минуту молекула фотолиазы может расщепить 2,4 димера. У Е. coli система фотореактивации удаляет до 90% пиримидиновых димеров и контролируется одним геном - phr. Штаммы, несущие мутацию по этому гену, не способны к репарации ДНК.
Фотореактивации подвергаются только циклобутановые димеры. Надо отметить, что это пока почти единственная, известная ферментная реакция, в которой фактором активации служит не химическая энергия, а энергия видимого света. Дезоксирибозидпиримидинфотолиаза широко распространена у разных органических форм и представлена даже у таких примитивных микроорганизмов, как микоплазмы. Она есть у всех изученных бактерий, кроме Micrococcus radiodurans, которые чрезвычайно устойчивы к действию УФ-лучей и выдерживают дозы в 1 000 раз более высокие, чем те, что детальны для E.coli. Фотолиаза обнаружена в клетках многих растений и животных, в том числе и у человека. По-видимому, наибольшее значение фотореактивация имеет у растений.
Эксцизионная репарация
Существуют системы генетической репарации, работа которых напоминает «хирургическое» вмешательство в структуру ДНК: поврежденные участки вырезаются из цепи ДНК, отсюда происходит и термин «эксцизиониая репарация» (англ. excision -вырезание). Сам феномен известен еще с 1955 г., однако, молекулярный механизм эксцизионной репарации был раскрыт гораздо позже - в 1964 г., в результате работ нескольких групп исследователей налиниях мутантных бактерий, чувствительных к действию радиации. Оказалось, что данный тип генетической репарации обеспечивает вырезание неверного или поврежденного нуклеотида/участка ДНК, последующую синтез застройку бреши и лигирование. К этому типу относится несколько специализированных механизмов, например, гликозилазы удаляют лишь модифицированные основания, АР-эндонуклеазы — апуриновые сайты, и т.п. По-видимому, именно системы эксцизионной репарации восстанавливают большую часть повреждений ДНК в клетке.
Общая схема эксцизионной репарации, действующей по принципу «режь-латай», включает несколько этапов:
1. Узнавание повреждения УФ-эндонуклеазой (у E.coli этот фермент называют UvrABC-эндонуклеазой);
В случае пиримидиновых димеров или моноаддуктов повреждение распознается легко. В других случаях, например, при неправильном спаривании нуклеотидов, оба нуклеотида (правильный и неверный) эквивалентны для многих видов эксцизионной репарации, однако существуют специализированные системы, позволяющие в большинстве случаев восстанавливать нативную структуру.
2. Инцизия (надрезание) цепи ДНК этим ферментом по обе стороны от повреждения;
3. Эксцизия (вырезание и удаление) фрагмента ДНК, содержащего повреждение, происходит при участии геликазы - фермента, расплетающего молекулу ДНК для высвобождения концов после первичных надрезов;
4. Ресинтез, в ходе которого ДНК-полимераза I застраивает образовавшуюся брешь благодаря своей 5'-3'-полимеразной активности, а ДНК-лигаза ковалентно присоединяет 3'-конец вновь синтезированного материала к ранее синтезированной ДНК.
Эксцизионная репарация ДНК завершается при возникновении ковалентных связей репарированного участка со скелетом полинуклеотида. Таким образом, обеспечивается непрерывность в ранее поврежденной цепи двухцепочечной молекулы ДНК. В целом, эксцизионная репарация обычно распознает нарушения вторичной структуры ДНК (двойной спирали)
и т.д................. Эксциз 7 октября были объявлены лауреаты Нобелевской премии по химии 2015 года. Ими стали британец шведского происхождения Томас Линдаль(Tomas Lindahl), американец Пол Модрич (Paul L. Modrich) и американец турецкого происхождения Азиз Санджар (Aziz Sancar). Нобелевский комитет отметил вклад этих ученых в исследование механизмов восстановления (репарации) ДНК — важной внутриклеточной системы, нацеленной на поиск и исправление многочисленных повреждений, возникающих при нормальной репликации ДНК в клетке или в результате воздействия физических или химических агентов. Нарушение работы этой системы связано с целым рядом тяжелых наследственных болезней, да и вообще, без нее сложные формы жизни вряд ли бы могли существовать.
