Тема: Вивчення властивостей ферментів

Дослід 11.1 Вивчення дії амілази.

Принцип методу. Амілаза є ферментом, який каталізує гідроліз a-1-4-крохмалю та глікогену до проміжних продуктів - декстринів. Крохмаль утворює з йодом сполуки синього кольору, амілодекстрін - фіолетового, еритродекстрін - червоно-бурого, ахродекстрин - жовтого.

Матеріали та реактиви. Розчин крохмалю (0.2%), 0.1% розчин йоду в 0.2% розчині йодиду калію, розчин слини - рот два-три рази ополоскують водою, відмірюють циліндром 50 мл дистильованої води й полощуть нею рот кілька разів протягом 3-5 хв. Зібрану рідину фільтрують через вату. Фільтрат використовують як джерело ферменту.

Обладнання. Штатив із пробірками; піпетки, крапельниці.

Хід роботи.

У дві пробірки наливають по 5 мл крохмального клейстеру, в одну з них додають 0.5 мл розчину слини, яка містить амілазу, добре перемішують і залишають стояти за кімнатної температури. Через 15 хв у обидві пробірки додають по п'ять краплин розчину йоду. В пробірці з амілазою слини розчин через 1 годину знебарвлюється, а в пробірці без амілази колір розчину не змінюється, тобто залишається синьо- фіолетовим.

 

Дослід 11.2 Вивчення термолабільності ферментів. Вплив

температури на активність амілази слини.

Принцип методу. Швидкість розщеплення крохмалю під дією амілази залежить від температури й визначається за інтенсивністю забарвлення розчину крохмалю або продуктів його перетворення з йодом.

Матеріали та реактиви. Розчин крохмалю (1%), розчин слини, 0.1% розчин йоду в 0.2% розчині йодиду калію, лід.

Обладнання. Штатив із пробірками, піпетки, водяна баня, термостат, скляні палички, скляні або фарфорові пластинки.

Хід роботи.

У чотири пронумеровані пробірки наливають по 5 мл розчину крохмалю. Пробірку вміщують у киплячу водяну баню, пробірку 2 - у водяну баню за температури 40⁰С, пробірку 3 -залишають за кімнатної температури, а в пробірку 4 - ставлять у лід. Через 15 хвилин у всі пробірки, залишаючи

їх за тих же умов, додають по 1 мл розчину слини та перемішують скляною паличкою. За гідролізом крохмалю стежать за реакцією з йодом. Для цього на скляну або фарфорову пластинку наносять кілька краплин розчину йоду й змішують їх із краплинами суміші, яку беруть з кожної пробірки через 1, 2, 4, 6, 8, 10. 12 хвилин. За зміною забарвлення розчину крохмалю з йодом судять про гідроліз у кожній пробірці. У пробірці 1, що містилася на водяній бані за температури І00⁰С, суміш забарвлюється в синій колір. Фермент у ній інактивований, і гідроліз крохмалю не відбувається. В інших пробірках забарвлення залежить від ступеня гідролізу крохмалю: в пробірці 2 за оптимальної температури (40°С) - жовте, в пробірках 3 і 4 колір розчинів може бути червоним чи фіолетово-червоним.

 

Дослід 11.3 Вивчення залежності ефективності ферментів від рН

середовища. Вплив рН на активність амілази.

Принцип методу. За впливом рН на активність амілази визначають зміну інтенсивності забарвлення розчину крохмалю з йодом. Оптимум рН для амілази слини становить 6.8, в кислому та лужному середовищах активність амілази знижується.

Матеріали та реактиви. Розчин слини, 1% розчин крохмалю, 0.1% розчин йоду в 0.2% розчині йодиду калію, фосфатний буфер з різними значеннями рН (табл.). Загальний об"єм буферного розчину 100 мл.

Обладнання. Штатив із пробірками, піпетки, крапельниці, термостат.

Хід роботи.

У сім пробірок наливають по 2 мл буферного розчину з різними значеннями рН (табл.). Потім доливають по 5 мл розчину крохмалю та по 1 мл розчину слини. Вміст пробірок перемішують і ставлять у термостат на 10 хвилин за температури 38°С. Після інкубації в термостаті в усі пробірки додають по 5 краплин розчину йоду, перемішують, спостерігають забарвлення й відзначають активність. Для наочності в кожну пробірку можна долити трохи дистильованої води й розмішати.

 

рН	Nа 2НРО4 (0,2 моль/л)	NаН2 РО4 (0,2 моль/л)
5,8	4,00	46,00
6,2	9,25	40,75
6,6	18,75	31,25
6,8	24,50	25,50
7,2	36,0	14,00
7,6	43,50	6,50
8,0	47,35	2,65

 

Дослід 11.4 Дія активаторів та інгібіторів на активність,амілази

Принцип методу. Активатором амілази є NаСІ, а інгібітором - СuS0₄, Вплив цих речовин на активність амілази визначають за ступенем гідролізу крохмалю під впливом ферменту за наявності NаСІ і СuS0₄.

Матеріали та реактиви. Розчин слини, 0.5% розчин крохмалю, 0.1% розчин йоду в 0.2% розчині йодиду калію, 1% розчин NаСІ, 1% розчин СuS0₄.

Обладнання. Штатив із пробірками, піпетки, крапельниці, термостат.

Хід роботи.

Готують три пробірки. В першу наливають 2.5 мл води, в другу - 2 мл

води та 0.5 мл розчину NаСІ, у третю - 2 мл води та 0.5 мл розчину СuS0_4.У всі пробірки додають по 2.5 мл розчину слини, перемішують, вносять по 2.5 мл розчину крохмалю, потім знову перемішують і ставлять у термостат за температури 38°С. Через 5 хвилин додають по 5 краплин розчину йоду. Рідина в першій пробірці забарвлюється в фіолетовий або червоний колір, у другій - у червоний або жовтий, у третій - у синій. Одержані результати свідчать, що активатором амілази є NаСІ (друга пробірка), а інгібітором - СuS0₄-(третя пробірка).

Дослід 11.5 Вивчення специфічності дії ферментів. Специфічність

дії амілази та сахарази.

Принцип методу. Амілаза розщеплює полісахарид крохмаль і не діє на дісахариди (мальтозу або сахарозу). Сахараза розщеплює тільки сахарозу й не розщеплює крохмаль та інші дісахариди.

Матеріали та реактиви. Розчин слини, 0.5% розчин крохмалю, 0.5% розчин сахарози, 0.1% розчин йоду в 0.2% розчині йодиду калію, реактив Фелінга та препарат сахарази.

Обладнання. Штатив із пробірками, піпетки, водяна баня, крапельниці, термостат.

Хід роботи.

У дві пробірки наливають по 3 мл розчину крохмалю. У першу додають 1мл розчину слини (амілази), в другу - 1 мл препарату сахарази, потім

перемішують і ставлять у термостат (38°С).

У дві інші пробірки наливають по 3 мл розчину сахарози. У першу

додають 1 мл препарату сахарази. а другу - 1 мл розчину слини й

залишають за тих самих умов.

Через 5 хвилин у перші дві пробірки з крохмалем додають по 5 краплин

розчину йоду й спостерігають за забарвленням. У пробірці з амілазою

сине забарвлення розчину зникає внаслідок розщеплення крохмалю

амілазою. У другій пробірці розчин має синій колір, тому що сахараза не діє на крохмаль.У двох інших пробірках дія ферменту виявляється за позитивною реакцією з реактивом Фелінга на наявність моносахаридів. Для цього в пробірки додають по 1 мл реактиву Фелінга та нагрівають до кипіння. Сахароза відновних властивостей не має, тому в пробірці, де під впливом сахарази сахароза розщепилася на глюкозу та фруктозу, спостерігається червоне забарвлення внаслідок утворення геміоксиду міді.

Дослід 11.6 Вивчення активності амілази слини за методом

Вольгемута.

Принцип методу. Метод Вольгемута грунтується на визначенні мінімальної кількості ферменту, яка здатна за певних умов повністю гідролізувати 1 мл 0.1% розчину крохмалю. Амілазна активність слини визначається кількістю 0.1% розчину крохмалю, мл, яку може гідролізувати 1 мл нерозбавленої слини за температури 38°С протягом 30 хвилин. У нормі амілазна активність становить 160-320. Метод Вольгемута широко застосовується в клінічній практиці для визначення амілазної активності крові та сечі, в пивоварінні - солоду. Різке підвищення амілазної активності крові та сечі (в 10-30 раз) спостерігається при гострих панкреатитах, пухлинах підшлункової залози.

Матеріали та реактиви. Слина розбавлена в десять разів, 0.1% розчин крохмалю, 0.1% розчин йоду в 0.2% розчині йодиду калію.

Обладнання. Штатив із пробірками, піпетки, крапельниці, термостат.

 

Хід роботи.

У десять пробірок наливають по 1 мл дистильованої води. У першу додають 1 мл розведеної в десять разів слини, перемішують і 1 мл суміші переносять у другу пробірку. Вміст цієї пробірки знову перемішують, 1 мл суміші переносять у третю пробірку й так до десятої. З останньої пробірки відбірають 1 мл суміші і виливають. Таким чином, у кожній наступній пробірці вміст ферменту вдвічі менший, ніж у попередній і розведення слини в пробірках становитиме: 1:10, 1:20. 1:40, 1:80, 1:160,. 1:320, 1:640. 1:1280, 1:2560, 1:5120, 1:10240.

Далі в усі пробірки додають по 1 мл води та по 2 мл розчину крохмалю, перемішують і ставлять у термостат за температури 38°С на 30 хвилин. Після інкубації пробірки охолоджують водопровідною водою для припинення дії ферменту, додають по дві краплини розчину йоду добре збовтують і спостерігають за зміною забарвлення. Під час реакції з йодом рідина забарвлюється в жовтий, рожевий та фіолетовий кольори. Зазначають, за якого розведення відбувся повний гідроліз крохмалю з мінімальним вмістом ферменту (пробірка з жовтуватим забарвленням рідини). За кількістю нерозведеної слини (А), в цій пробірці розраховують амілазну активність слини (А мл слини розщеплює х мл 0.1% розчину крохмалю). Наприклад, жовтуватий колір з'явився в четвертий пробірці, де слина розведена в 160 разів. Цю кількість слини може гідролізувати 2 мл 0.1% розчину крохмалю, а 1 мл нерозведеної слини за подібних умов гідролізує 320 мл: х = 2•160/1. Отже, амілазна активність слини дорівнює 320.

Дослід11.7 Вивчення дії тирозинази.

Принцип методу. Тирозиназа каталізує перетворення тирозину в меланін (пігмент чорного кольору) через забарвлені в червоний колір проміжні продукти - 3,4-діоксифенілаланін (ДОФА), який внаслідок окислення та циклізації перетворюється на 2,3-дигідро-5,6-діокси-b-індолілкарбонову кислоту (1). Сполука (1), окислюючись, перетворюється на 2,3-дигідро-5,6-дикето-b-індолілкарбонову кислоту (2) - пігмент червоного кольору:

 

 

Матеріали та реактиви. Препарат тирозинази (10г подрібненої картоплі розтирають у ступці з 30мл води й фільтрують крізь два шари марлі), насичений розчин тирозину.

Обладнання. Фарфорова ступка з товкачиком, пробірки, піпетки, водяна баня,термостат (1-40°С).

Хід роботи.

У дві пробірки (досліджувальна проба та контроль) наливають по 1 мл

препарату тирозинази. Вміст контрольної пробірки кипятять 3 хвилини і

охолоджують. Потім у кожну пробірку додають по 0.5 мл насиченого

розчину тирозину й ставлять у термостат за температури 40°С. Кожні 5

хвилин пробірки струшують. У пробірці з неінактивованою тирозиназою

рідина поступово забарвлюється в рожевий, бурий і чорний кольори.

Дослід 11.8 Вивчення дії сахарази.

Принцип методу. Сахараза каталізує гідроліз сахарози до глюкози та фруктози:

С₁₂Н₂₂О₁₁+Н₂О®2С₆Н₁₂О₆

Моносахариди, які утворюються, визначають реакцією Фелінга. Сахароза не містить вільної альдегідної групи й тому не має відновних властивостей.

Матеріали та реактиви. Препарат сахарази (5 г пивних дріжджів розтирають у фарфоровій ступці з 2-3 мл дистильованої води та невеликою кількістю скляного піску, додають 8-10 мл води та фільтрують через вату), 2% розчин сахарози, реактив Фелінга, який складається з двох розчинів, які готують таким чином:

А) 40 г сегнетової солі та 30 г гідроксиду натрію розводять у мірній колбі об'ємом 200 мл і доливають водою до риски;

Б) 8 г СuSO₄ · 5Н₂О розводять у колбі такого ж об'єму й заливають водою до риски. Перед використанням змішують рівні об'єми цих розчинів.

Обладнання. Пробірки, піпетки, фарфорова ступка з товкачиком, лійки, термостат,водяна баня, газовий пальник.

Хід роботи.

У дві пробірки наливають по 1 мл препарату ферменту. Вміст однієї з них (контроль) кип'ятять протягом 3 хвилин для руйнування сахарази, після чого в обидві пробірки додають (охолоджені) по 3 мл розчину сахарози, добре перемішують і ставлять у термостат за температури 38°С. Через 15 хвилин у пробірки вносять по 2 мл реактиву Фелінга, перемішують і нагрівають до кипіння. У контрольній пробірці з активним ферментом (дослід) утворюється червоний осад геміоксиду міді.

Питання і вправи

До теоретичної частини:

1. Які функції ферментів?

2. В чому різниця між біологічними каталізаторами і каталізаторами, які застосовуються в хімії?

3. В чому полягає особливість будови ферментів?

4. Чому розщеплення крохмалю до декстринів йде швидше при 60°С, а ніж при 80°С?

5. Як впливає концентрація Н на швидкість ферментативних реакцій?

6. Як впливає температура на швидкість ферментативних процесів?

7. Чому сечовина під дією уреази перетворюється на вуглекислий газ і

аміак, а фенілмочевина залишається без змін?

8. За якими ознаками класифікують ферменти? Яка специфіка дії кожного з класів ферментів?

9. Які існують загальні уявлення про механізм дії ферментів?

До експериментальної частини:

10. Як можна довести, що ферменти вразливі до дії високих температур? 11. Як визначають рН середовища?

12. Що таке активатори та інгібітори дії ферментів?

13. Як впливає реакція середовища на активність ферментів?

14.Як можна визначити активність ферментів?

ЛАБОРАТОРНА РАБОТА № 12