Ћекции.ќрг


ѕоиск:




 атегории:

јстрономи€
Ѕиологи€
√еографи€
ƒругие €зыки
»нтернет
»нформатика
»стори€
 ультура
Ћитература
Ћогика
ћатематика
ћедицина
ћеханика
ќхрана труда
ѕедагогика
ѕолитика
ѕраво
ѕсихологи€
–елиги€
–иторика
—оциологи€
—порт
—троительство
“ехнологи€
“ранспорт
‘изика
‘илософи€
‘инансы
’ими€
Ёкологи€
Ёкономика
Ёлектроника

 

 

 

 


ћетоды изучени€ вирулентных фагов




ѕодготовка материала

ћатериалом, из которого выдел€ют фаг, обычно €вл€ютс€ фильтраты, полученные с помощью бактериальных фильтров из объектов внешней среды, органов и выделений человека и животных, культур микроорганизмов и т. д.

ѕеред фильтрацией исследуемый материал подготавливают следующим образом:

∆идкости (кровь, мочу, воду, смывы с предметов и т. п.) освобождают от крупных частиц с помощью бумажного фильтра или центрифугированием, чтобы они не забили поры бактериального фильтра.

¬€зкий материал (гной, кал) эмульгируют в изотоническом растворе натри€ хлорида или бульоне, после чего освобождают от крупных частиц, как описано выше.

ѕлотный материал (кусочки органов, пищи и т. п.) предварительно измельчают - обычно растирают в ступке со стерильным кварцевым песком. ¬место песка можно использовать стерильные кончики пастеровских пипеток или битые покровные стекла. –астертый материал тщательно эмульгируют в изотоническом растворе натри€ хлорида или бульоне и освобождают от крупной взвеси.

ѕодготовленный материал пропускают через бактериальный фильтр, освобожда€ от посторонней микрофлоры.

 ультуры микроорганизмов (известные или изучаемые). ¬ работе с фагом примен€ют 20-24-часовые культуры, выращенные на агаре, или 2-6-часовые культуры в жидких средах. „истоту культуры устанавливают в мазках, окрашенных фуксином ѕфейффера или по √раму. »з культур, выращенных на скошенном агаре, готов€т взвесь. ¬ пробирку с культурой наливают 3-5 мл изотонического раствора натри€ хлорида. ¬раща€ пробирку между ладон€ми, осторожно смывают культуру с поверхности среды так, чтобы не намочить пробку. ¬звесь перенос€т в стерильную пробирку и развод€т изотоническим раствором натри€ хлорида 1:10 (0,5 мл взвеси в 4,5 мл раствора).

ѕри работе с фагом необходима стерильна€ посуда (градуированные и пастеровские пипетки, чашки ѕетри, пробирки, колбы, ступки), термостат, фильтровальное устройство, центрифуга, штативы, прибор дл€ счета колоний.

¬нимание! ¬с€ работа с фагом требует соблюдени€ асептики.

 ачественные методы

ќ наличии фага в том или ином субстрате узнают по лизису чувствительной к нему микробной культуры (тест-культура).

ќбнаружение фага на плотных средах. “ест-культуру засевают "газоном" (см. главу 7) на поверхность агара в чашке ѕетри. ѕосев подсушивают в термостате 30-40 мин при открытой крышке, после чего на него нанос€т каплю изучаемого материала. „ерез несколько минут, когда жидкость впитаетс€, чашки помещают в термостат на 18-20 ч. ≈сли в изучаемом материале есть фаг, произойдет лизис культуры и на месте, куда была нанесена капл€, культура или совсем не вырастет (сплошной лизис) или образуютс€ отдельные колонии фага.

ќбнаружение фага в жидких средах. ¬ две пробирки с одинаковым количеством бульона внос€т по одной капле культуры, микроба, в отношении которого изучают фаг. ¬ одну из них добавл€ют исследуемый фаг или фильтрат материала, в котором его определ€ют. ¬тора€ пробирка служит контролем роста культуры. ѕробирки помещают в термостат на 12-20 ч. ”чет результатов производ€т только при наличии роста культуры в контроле (помутнение среды). ќтсутствие видимого роста или последующее просветление среды в пробирке с исследуемым материалом свидетельствует о присутствии фага. ≈сли содержимое этой пробирки мутное, исследование необходимо дополнить посевом на плотную среду: помутнение могло произойти от роста устойчивой к фагу культуры. “олько в том случае, если в посеве на агар фаг не будет обнаружен, можно сделать вывод, что его нет в изучаемом материале.

 оличественные методы

 оличественные методы имеют большое значение при проведении многих исследований, в том числе и фага. ¬рачу нужно знать активность фага, чтобы правильно установить его дозу при лечебно-профилактическом применении, исследователю - чтобы вы€снить, как измен€етс€ активность фага в эксперименте.

јктивность фага выражают пон€тием титр, различа€ титр фага в жидкой и на плотной среде.

ѕри исследовании в жидкой среде (по јппельману) титр фага - это наибольшее его разведение (или наименьшее количество), которое подавл€ет рост тест-культуры в услови€х данного опыта.

Ќа плотной среде (титрование по √рациа) титр фага - количество частиц (корпускул) фага в 1 мл исходного материала.

“итрование фага по јппельману (в жидкой среде). ѕри титровании фага объем и состав среды, температура, аэраци€, количество микробов, пробирки, в которых провод€т титрование (диаметр, конфигураци€ дна, толщина стекла), должны быть одинаковыми. »змен€етс€ только количество фага.

¬се компоненты, участвующие в биологических опытах, подлежат об€зательному контролю на правильность их работы.

ѕри титровании фага став€т контроль фага и бульона на стерильность, контроль культуры - на ее жизнеспособность.

ѕостановка опыта. 1. ¬ 12 стерильных пробирок наливают по 4,5 мл стерильного бульона. ”ровень жидкости во всех пробирках должен быть одинаковым. ≈сли это не так, значит допущена ошибка. ¬ этом случае нестандартную пробирку замен€ют новой и заново наполн€ют бульоном. ѕри разливе бульона пользуютс€ пипетками вместимостью 5-10 мл.

2. ѕробирки став€т в штатив и нумеруют от 1 до 10, на одной из оставшихс€ пробирок пишут "  " (контроль культуры), на другой - " ‘" (контроль фага). ¬се пробирки, в которых провод€т опыт, должны быть надписаны.

3. ¬ дес€ти пробирках готов€т последовательные дес€тикратные разведени€ фага от 10-1 до 10-10 (табл. 9). ¬ 1-ю пробирку внос€т 0,5 мл фага. “акое же количество внос€т в пробирку контрол€ фага. —менив пипетку, новой пипеткой тщательно перемешивают содержимое 1-й пробирки и перенос€т 0,5 мл его во 2-ю пробирку; 0,5 мл содержимого 2-й пробирки перенос€т в 3-ю и так далее до 10-й пробирки, мен€€ каждый раз пипетки. ѕеремешав содержимое 10-й пробирки, 0,5 мл жидкости из нее выливают в дезинфицирующий раствор. “акже поступают с содержимым пробирки контрол€ фага. ƒл€ разведени€ фага пользуютс€ пипетками вместимостью 1-2 мл. ѕровер€ют уровень жидкости в пробирках. ќн должен быть одинаковым.


“аблица 9. —хема титровани€ фага по јппельману

”словные обозначени€: + рост культуры, - отсутствие роста культуры.

ѕримечание. —трелки указывают перенос фага из пробирки в пробирку. »з пробирки 10 и из пробирки контрол€ фага 0,5 мл выливают в дезинфецирующий раствор.

4. ¬о все пробирки, кроме пробирки контрол€ фага, внос€т по 1 капле (0,05 мл) взвеси тест-культуры. ѕробирки встр€хивают. ¬о всех пробирках, кроме пробирки контрол€ фага, должна по€витьс€ слегка заметна€ муть. ≈сли этого не происходит, все операции с нестандартной пробиркой повтор€ют вновь.

5. ѕробирки помещают в термостат на 18-20 ч, после чего учитывают результат титровани€. ”чет результатов об€зательно начинают с контролей.

ѕри правильной постановке опыта в контроле культуры должно быть размножение бактерий - содержимое пробирки становитс€ мутным. Ётот контроль позвол€ет сделать вывод, что вз€та€ в опыт культура жизнеспособна и что питательна€ среда обеспечивает ее развитие в данных услови€х опыта. «начит, если в пробирках с фагом культура не выросла, на нее подействовал фаг.

∆идкость в пробирке с контролем фага должна остатьс€ прозрачной. Ётот контроль позвол€ет сделать вывод, что посуда, бульон и фаг стерильны.

ѕри правильных результатах в контрол€х регистрируют характер изменений в первых дес€ти пробирках. –ост культуры в пробирках "опытного" р€да говорит об отсутствии или недостаточном количестве в них фага. ”станавливают титр фага, т. е. его наибольшее разведение, в котором произошел лизис культуры (содержимое пробирки прозрачно). ќбозначают титр степенью разведени€ фага с обратным знаком, что соответствует пор€дковому номеру пробирки. Ќапример, если культура не растет в первых семи пробирках, титр фага равен 10-7 (см. табл. 9).

“итрование фага по √раци€ (на плотной среде) методом агаровых слоев позвол€ет определить количество частиц фага в титруемом материале. ћетод основан на том, что кажда€ частица фага дает зону просветлени€ (лизиса) на чашке с газоном чувствительного к нему микроба, т. е. образует отдельную колонию.

ѕостановка опыта. „ашки с 20-25 мл ћѕј покрывают стерильной фильтровальной бумагой и подсушивают в термостате или под бактерицидной лампой (рассто€ние от лампы не более 2 м). “итруемый фаг развод€т от 10-1 до 10-10 (как в предыдущем опыте) и по 1 мл перенос€т в другие пронумерованные пробирки (соответственно из 1-й в 1-ю и так далее до 10-й), в которые заранее наливают по 2,5 мл 0,7% ћѕј, расплавленного и остуженного до 45∞ —. ¬ каждую из этих пробирок добавл€ют по 0,1 мл тест-культуры. —одержимое пробирок быстро перемешивают (не дать застыть агару) и выливают на поверхность среды в чашки ѕетри с номерами, соответствующими номерам пробирок. „ерез 30 мин чашки став€т в термостат.

”чет результатов провод€т через 18-20 ч. ѕри большой концентрации фага (в первых чашках) произойдет сплошной лизис культуры. ¬ тех разведени€х фага, в которых находилось небольшое количество частиц фага, по€в€тс€ изолированные колонии, которые подсчитывают. „тобы не ошибитьс€ в счете, каждую учтенную колонию помечают со стороны дна чашки. јппарат дл€ счета колоний намного облегчает работу (см. рис. 54). „тобы установить количество частиц фага в 1 мл фаголизата, пользуютс€ формулой: n = y×x, где n - искомое число; y - количество выросших на чашке колоний фага; x - разведение фага в чашке, в которой подсчитаны колонии.

Ќапример, если в чашке с разведением фага 10-8 (1:108) выросло 25 колоний, то в 1 мл исходной жидкости содержитс€ 25×108 или 2,5×109частиц фага.

Ѕолее точные результаты получают, если определ€ют количество частиц фага в исходной жидкости по нескольким разведени€м и вычисл€ют среднее арифметическое. Ќапример, при разведении фага 10-6 выросло 320 колоний, следовательно, в 1 мл исходной жидкости было 320×10 или 3,2×108 частиц фага. ѕри разведении фага 10-7 выросло 42 колонии, следовательно, в исходной жидкости было 4,2×108/мл частиц фага. ѕри разведении фага 10-8 выросло 5 колоний, следовательно, в исходной жидкости было 5×108/мл частиц фага. —ложив величины, полученные при этих подсчетах и разделив сумму на 3 (количество проведенных подсчетов), устанавливают число частиц фага в 1 мл титруемого препарата. ¬ нашем примере оно равно 4,1×108.

ѕодсчитывать колонии лучше всего на чашках, где выросло не меньше 5 и не больше 50 колоний. ¬ противном случае страдает точность подсчЄта. ≈сли на чашке много колоний, чашку можно разделить на несколько секторов, сосчитать колонии на одном из них и полученную цифру умножить на количество секторов.

 ак правило, все биологические исследовани€ провод€т в трех параллельных опытах. ¬ данном примере каждое разведение фага одновременно титруют трижды.

ћетоды выделени€ фагов

ѕр€мой метод. ‘аг получают и изучают непосредственно в фильтратах исследуемого материала. ќ наличии и активности фага узнают по лизису чувствительной к нему культуры.

 ак правило, пр€мой метод не дает убедительных результатов из-за малого количества содержащегос€ в фильтрате фага. ƒл€ повышени€ его количества используют методы обогащени€.

ћетод обогащени€. ѕодготовленный фильтрат внос€т в 2-3-часовую бульонную культуру соответствующих микроорганизмов. ѕосев инкубируют в термостате. ‘аг размножаетс€ в клетках культуры и титр его значительно увеличиваетс€. ѕосле этого бульон фильтруют и в фильтрате определ€ют свойства и активность фага.





ѕоделитьс€ с друзь€ми:


ƒата добавлени€: 2016-11-22; ћы поможем в написании ваших работ!; просмотров: 675 | Ќарушение авторских прав


ѕоиск на сайте:

Ћучшие изречени€:

Ѕольшинство людей упускают по€вившуюс€ возможность, потому что она бывает одета в комбинезон и с виду напоминает работу © “омас Ёдисон
==> читать все изречени€...

840 - | 656 -


© 2015-2024 lektsii.org -  онтакты - ѕоследнее добавление

√ен: 0.02 с.