Ћекции.ќрг


ѕоиск:




 атегории:

јстрономи€
Ѕиологи€
√еографи€
ƒругие €зыки
»нтернет
»нформатика
»стори€
 ультура
Ћитература
Ћогика
ћатематика
ћедицина
ћеханика
ќхрана труда
ѕедагогика
ѕолитика
ѕраво
ѕсихологи€
–елиги€
–иторика
—оциологи€
—порт
—троительство
“ехнологи€
“ранспорт
‘изика
‘илософи€
‘инансы
’ими€
Ёкологи€
Ёкономика
Ёлектроника

 

 

 

 


–ецепты приготовлени€ сложных сред




—реды с углеводами.   основному бульону или расплавленному агару прибавл€ют нужное количество (0,1-2%) определенного углевода (например, глюкозы). ѕосле его растворени€ разливают в стерильную посуду и стерилизуют текучим паром. ѕоскольку углеводы частично разрушаютс€ даже при таком режиме стерилизации, предпочтительнее 25-30% раствор углеводов, простерилизованный через бактериальный фильтр, добавл€ть в нужном объеме с соблюдением асептики к стерильным основным средам - после контрол€ стерильности среда готова к употреблению.

—реды с кровью готов€т из стерильных простых сред, добавл€€ в асептических услови€х (лучше в боксе) от в до 30% (обычно 5%) стерильной дефибринированной крови. јгаровые среды перед этим растапливают и остужают до 45∞ —. ќпредел€ют температуру среды, поднос€ сосуд к шее у угла нижней челюсти. ѕри нужной температуре должно быть терпимое ощущение гор€чего, но не ожога. ѕосле добавлени€ крови, пока среда не застыла, содержимое сосуда тщательно перемешивают и разливают в чашки или пробирки.

¬нимание! —реды с кровью растапливать нельз€ - кровь изменит свои свойства.

—реды с сывороткой крови готов€т так же, как среды с кровью.   основным средам добавл€ют 10-20% сыворотки, не содержащей консерванта и предварительно инактивированной при 56∞ — в течение 30 мин на вод€ной бане или в инактиваторе. ѕри инактивации разрушаетс€ вещество (комплемент), губительно действующее на микробы.

—реды с желчью.   простым средам добавл€ют желчь в количестве 10-40% объема среды, устанавливают нужный рЌ и стерилизуют 20 мин при 120∞ —. ћожно стерильную желчь добавить к стерильной среде в асептических услови€х.

–азлив агаровых сред в чашки ѕетри. —реды перед разливом расплавл€ют на вод€ной бане и остужают до 45-50∞ —. ќбычно дл€ чашки диаметром 9 см достаточно 15-20 мл среды (высота сло€ 0,25-0,3 см). ≈сли слой выше, на нем менее контрастно выгл€д€т колонии. ѕри очень тонком слое резко ограничено количество питательных веществ и влаги (среда быстро высыхает) - ухудшаютс€ услови€ культивировани€.

–азливают среды в стерильные чашки в асептических услови€х. „ашки став€т крышкой вверх. —осуд со средой берут в правую руку, держа его у огн€. Ћевой рукой вынимают пробку, зажав ее мизинцем и ладонью. ќбжигают горлышко сосуда и двум€ пальцами левой руки слегка приоткрывают крышку. ¬вод€т под нее горлышко флакона, не прикаса€сь им к краю чашки. Ќалива€ среду, след€т чтобы она равномерно распределилась по дну чашки. ≈сли при разливе на поверхности среды образуютс€ пузырьки воздуха, к ним до того, как среда застынет, поднос€т плам€ спички или горелки - пузырьки лопнут. «атем чашку закрывают и дают среде застыть. ≈сли посев производ€т в день разлива, среду необходимо подсушить. ƒл€ этого чашки в термостате осторожно открывают и устанавливают крышки и чашки открытой стороной вниз на 20-30 мин. ≈сли посев производ€т на следующий день после разлива, чашки, не подсушива€, завертывают в ту же бумагу, в которой их стерилизовали, и помещают в холодильник.

ѕриготовление скошенного агара. ѕробирки с 4-5 мл стерильной расплавленной агаровой среды укладывают в наклонном положении (примерно под углом 20 ∞) с таким расчетом, чтобы среда не заходила за 2/3 пробирки, иначе она может смочить пробку. ѕосле того как среда застынет, пробирки став€т вертикально - дают стечь конденсату. Ћучше употребл€ть свежескошенный агар.

¬нимание! ѕользоватьс€ средой, в которой нет конденсата, нельз€. ≈е следует снова растопить на вод€ной бане и скосить.

—ухие среды

ќтечественна€ промышленность выпускает сухие среды разного назначени€: простые, элективные, дифференциально-диагностические, специальные. Ёто порошки во флаконах с завинчивающимис€ крышками. ’ран€т сухие среды в темном месте плотно закрытыми - они гигроскопичны. ¬ лаборатории из порошков готов€т среды по прописи на этикетке.

ѕреимущество сухих сред по сравнению со средами, изготовленными в лаборатории, - стандартность (их выпускают большими парти€ми), простота приготовлени€, делающа€ их доступными в любых (даже походных) услови€х, стабильность, экономичность. ¬ажно, что их можно готовить из заменителей м€са: гидролизата казеина, фибрина, кильки и даже белковых фракций микробных клеток (сарцин).

 онтрольные вопросы

1.  аким должен быть рЌ сред дл€ культивировани€ большинства патогенных микробов перед стерилизацией и почему?

2. ѕри какой температуре плав€тс€ и застывают агаровые среды?

3.  ак должна быть подготовлена посуда, в которую разливают среды с углеводами и белками?

«адание

1. ѕриготовьте ћѕЅ, ћѕј, бульон и агар ’оттингера с рЌ 7,2-7,4, разлейте во флаконы и пробирки; простерилизуйте.

2. ѕриготовьте из сухих порошков среды √исса, разлейте в пробирки по 4-5 мл и простерилизуйте.

3. ѕриготовьте агар с кровью и разлейте его в чашки ѕетри.

4. ѕриготовьте из сухих порошков среды Ёндо, Ёћ—, ѕлоскирева и разлейте их в чашки ѕетри.

5. ѕриготовьте скошенный агар.

ћетоды посевов

¬ажным этапом бактериологического исследовани€ €вл€етс€ посев. ¬ зависимости от цели исследовани€, характера посевного материала и среды используют разные методы посева. ¬се они включают об€зательную ÷ель: оградить посев от посторонних микробов. ѕоэтому работать следует быстро, но без резких движений, усиливающих колебани€ воздуха. ¬о врем€ посевов нельз€ разговаривать. ѕосевы лучше делать в боксе.

¬нимание! Ќе забывайте выполн€ть правила личной безопасности при работе с заразным материалом.

ѕосев из пробирки в пробирку. ѕробирку с посевным материалом и пробирку со средой держат слегка наклонно в левой руке между большим и указательным пальцами так, чтобы кра€ пробирок были на одном уровне, а их основани€ находились поверх кисти. ќбычно пробирку с посевным материалом держат ближе к себе. ¬ правой руке, как писчее перо, держат бактериальную петлю, и стерилизуют ее, держа вертикально в пламени горелки. ћизинцем и краем ладони правой руки вынимают обе пробки одновременно. »звлекают пробки не рывком, а плавно - легкими винтовыми движени€ми. ¬ынув пробки, кра€ пробирок обжигают в пламени горелки. ѕрокаленную петлю ввод€т через плам€ горелки в пробирку с посевным материалом, охлаждают и, набрав немного материала, осторожно перенос€т в пробирку со средой.

ѕри посеве в жидкую среду посевной материал растирают на стенке пробирки над жидкостью и смывают средой.

ѕри посеве на жидкие среды тампоном его погружают в среду и 3-5 с ополаскивают в ней. ѕри посеве на плотную среду материал втирают в ее поверхность, враща€ тампон, после чего тампон обеззараживают (помещают в пробирку, в которой он был доставлен в лабораторию, и автоклавируют).

¬нимание! —ледите, чтобы среда не вылилась и не смочила пробку.

ѕри посеве на скошенный агар материал обычно растирают на поверхности среды зигзагообразными движени€ми снизу вверх, начина€ от границы конденсата.

ѕри посеве на плотные среды, разлитые в пробирки столбиком, петлей с посевным материалом прокалывают столбик, производ€ так называемый посев "уколом".

ѕосле посева петлю извлекают из пробирки, кра€ пробирок обжигают и, провед€ пробки через плам€ горелки, закрывают пробирки, после чего прокаливают петлю.

ѕосев жидкого материала можно производить стерильными пипетками (пастеровскими или градуированными). ѕосле посева пипетки погружают в дезинфицирующую жидкость.

ѕосевы во флаконы, матрацы и бутыли производ€т примерно так, как в пробирки, только сначала набирают материал (петлей или в пипетку), а потом открывают сосуд со средой.

—осуды с засе€нной культурой надписывают и став€т в термостат.

ѕосев на пробирки с чашки ѕетри. »зучив характер роста культуры на чашке, со стороны дна отмечают восковым карандашом нужный дл€ посева участок. „ашку с посевным материалом став€т перед собой крышкой вверх. Ћевой рукой приоткрывают крышку и ввод€т под нее обожженную петлю. ќстудив петлю, набирают посевной, материал с отмеченного участка. ¬ынимают петлю, закрывают чашку и в левую руку берут пробирку со средой. ѕосев производ€т так же, как с пробирки в пробирку. ѕосле посева чашку поворачивают вверх дном.

ѕосев на агар в чашки ѕетри. ѕосев шпателем. Ўпатель - это стекл€нна€ или металлическа€ трубочка, конец которой загнут в виде треугольника. Ўпатель можно сделать из пастеровской пипетки, согнув под углом ее тонкий конец, предварительно разогретый в пламени горелки.

Ћевой рукой слегка приоткрывают крышку, держа ее большим и указательным пальцем. ѕетлей, пипеткой или стекл€нной палочкой нанос€т на поверхность среды посевной материал, после чего тщательно втирают его круговыми движени€ми шпател€ до тех пор, пока шпатель не перестанет свободно скользить по поверхности среды, левой рукой при этом придерживают крышку и одновременно вращают чашку. ѕо окончании посева шпатель вынимают из чашки и закрывают крышку. —текл€нный шпатель помещают в дезинфицирующий раствор, а металлический прокаливают в пламени горелки.

ѕосев петлей. Ќебольшое количество посевного материала (иногда его предварительно эмульгируют в стерильном изотоническом растворе или бульоне) втирают петлей в поверхность среды у кра€ чашки, несколько раз провод€ петлей из стороны в сторону. «атем у того места, где закончились штрихи, агар прокалывают петлей, снима€ избыток посевного материала. ќставшийс€ на петле посевной материал зигзагообразными движени€ми распредел€ют по всей поверхности среды. ѕо окончании посева закрывают чашку и прожигают петлю.

ѕосев петлей на секторы. „ашку со стороны дна расчерчивают на секторы. ѕосев производ€т зигзагообразными движени€ми от кра€ чашки к центру. Ќеобходимо следить, чтобы штрихи не заходили на соседний сектор.

ѕосев тампоном. “ампон с посевным материалом внос€т в слегка приоткрытую чашку и круговыми движени€ми втирают его содержимое в поверхность среды, враща€ при этом тампон и чашку.

ѕосев газоном. ѕримерно 1 мл (20 капель) жидкой культуры (если культура с плотной среды, ее эмульгируют в стерильном изотоническом растворе или бульоне) нанос€т на поверхность агара и тщательно распредел€ют жидкость по поверхности среды. „ашку слегка наклон€ют и пипеткой отсасывают избыток культуры, вылива€ ее в дезинфицирующий раствор. “уда же помещают пипетку.

ѕосев в толщу агара.  ультуру, выращенную на жидкой среде, или эмульгированный материал внос€т в сосуд с расплавленным и остуженным до 45∞ — агаром, перемешивают и выливают в стерильную чашку ѕетри. ћожно внести посевной материал в пустую чашку и залить 15-20 мл остуженного до 45∞ — агара. ƒл€ перемешивани€ содержимого чашки ее слегка покачивают и вращают. „ашки оставл€ют на столе до застывани€ среды.

«асе€нные чашки подписывают со стороны дна и помещают в термостат дном вверх.

 онтрольные вопросы

1. Ќужны ли асептические услови€ во врем€ посева? ќбоснуйте ответ.

2.  ак нужно обработать рабочее место по окончании посевов?

ћетоды культивировани€

ƒл€ успешного культивировани€, помимо правильно подобранных сред и правильно произведенного посева, необходимы оптимальные услови€: температура, влажность, аэраци€ (снабжение воздухом).  ак правило, подход€щие услови€ удаетс€ создать, тщательно воспроизвед€ услови€ природной обстановки.

“емпература. ќптимальную температуру дл€ культивировани€ большинства патогенных микроорганизмов (37∞ —) создают в термостате (рис. 17). Ёто прибор с двойными стенками, между которыми находитс€ воздух или вода, подогреваемые электричеством. ќн снабжен терморегул€тором, автоматически поддерживающим нужную температуру, и термометром дл€ контрол€ за температурой.


–ис. 17. “ермостат

ѕробирки с посевами в штативах, проволочных сетках или банках устанавливают на полках термостата. „ашки в термостате должны сто€ть вверх дном. „тобы воздух в термостате свободно циркулировал и нагрев был равномерным, полки в термостате делают с прорез€ми и плотно не загружают. „тобы не охладить культуры, термостат не оставл€ют надолго открытым.

Ћаборант об€зан ежедневно регистрировать температуру в термостате и поддерживать чистоту в приборе, а при неисправности вызвать мастера.

—вет подавл€ющему большинству микробов (к ним относ€тс€ все патогенные) не нужен - их культивируют в темноте. ќднако дл€ изучени€ пигментообразовани€, которое происходит активнее на рассе€нном свету, культуры после термостата выдерживают 2-3 дн€ при комнатном освещении.

¬нимание! —ледует избегать попадани€ пр€мых солнечных лучей, действующих на культуры губительно.

¬лажность. ∆изнь микробов невозможна без влаги - питательные вещества проникают в клетку только в растворенном виде. Ёто необходимо учитывать при культивировании на плотных средах: разливать их в чашки и скашивать в пробирках лучше в день посева. ѕри культивировании микробов, особенно чувствительных к отсутствию влаги, например гонококков, в термостат став€т открытый сосуд с водой.

—роки культивировани€. Ѕольшинство патогенных микробов культивируют 18-24 ч, но есть виды, растущие медленно (до 4-6 нед). „тобы сохранить в них влагу, ватные пробки после посева замен€ют стерильными резиновыми или надевают на них резиновые колпачки.

¬нимание! –езиновые пробки стерилизуют в автоклаве завернутыми в бумагу.

јэраци€. ѕо потребности микробов в свободном кислороде их дел€т на аэробы и анаэробы. ќбе группы требуют различных условий культивировани€.

ѕоступление кислорода, необходимого дл€ культивировани€ аэробов и факультативных анаэробов, осуществл€етс€ при пассивной и активной аэрации.

ѕассивна€ аэраци€ - это культивирование на плотных и жидких средах в сосудах, закрытых ватными или ватно-марлевыми пробками, или в чашках ѕетри. ѕри таком культивировании микробы потребл€ют кислород, растворенный в среде, наход€щийс€ в сосуде над средой и поступающий через пробку. ѕассивно аэрируемые культуры можно выращивать на поверхности или в тонком слое среды, куда проникает кислород воздуха.

јктивную аэрацию примен€ют при глубинном культивировании микробов, когда их выращивают в больших объемах среды. „тобы достаточно снабдить кислородом такие культуры, их помещают в специальные качалки - посто€нное перемешивание культуры обеспечивает соприкосновение ее с воздухом. ѕри культивировании в объемах жидкости, достигающих дес€тков и сотен литров, проводимом в приборах, называемых реакторами или ферментерами, воздух продувают через культуру при помощи специальных устройств.

 ультивирование анаэробов сложнее, чем аэробов, так как их необходимо лишить доступа свободного кислорода воздуха. ƒл€ этого удал€ют воздух из питательной среды различными способами.

 ультивирование актиномицетов, грибов, микоплазм, L-форм, спирохет и простейших.  ультивирование этих микроорганизмов принципиально сходно с культивированием бактерий. ƒл€ них разработаны специальные среды и подобраны режимы, соответствующие их потребност€м.

 ультивирование риккетсий и вирусов. –иккетсии и вирусы €вл€ютс€ облигатными паразитами, т. е. могут развиватьс€ только в живых клетках. »х культивируют в культурах тканей, организме экспериментальных животных, развивающихс€ куриных эмбрионах.





ѕоделитьс€ с друзь€ми:


ƒата добавлени€: 2016-11-22; ћы поможем в написании ваших работ!; просмотров: 1458 | Ќарушение авторских прав


ѕоиск на сайте:

Ћучшие изречени€:

ѕобеда - это еще не все, все - это посто€нное желание побеждать. © ¬инс Ћомбарди
==> читать все изречени€...

1275 - | 1226 -


© 2015-2024 lektsii.org -  онтакты - ѕоследнее добавление

√ен: 0.017 с.