Ћекции.ќрг


ѕоиск:




 атегории:

јстрономи€
Ѕиологи€
√еографи€
ƒругие €зыки
»нтернет
»нформатика
»стори€
 ультура
Ћитература
Ћогика
ћатематика
ћедицина
ћеханика
ќхрана труда
ѕедагогика
ѕолитика
ѕраво
ѕсихологи€
–елиги€
–иторика
—оциологи€
—порт
—троительство
“ехнологи€
“ранспорт
‘изика
‘илософи€
‘инансы
’ими€
Ёкологи€
Ёкономика
Ёлектроника

 

 

 

 


“ребовани€, предъ€вл€емые к средам




—реды должны соответствовать следующим требовани€м:

1) быть питательными, т. е. содержать в легко усво€емом виде все вещества, необходимые дл€ удовлетворени€ пищевых и энергетических потребностей. »ми €вл€ютс€ источники органогенов и минеральных (неорганических) веществ, включа€ микроэлементы. ћинеральные вещества не только вход€т в структуру клетки и активизируют ферменты, но и определ€ют физико-химические свойства сред (осмотическое давление, рЌ и др.). ѕри культивировании р€да микроорганизмов в среды внос€т факторы роста - витамины, некоторые аминокислоты, которые клетка не может синтезировать;

¬нимание! ћикроорганизмы, как все живые существа, нуждаютс€ в большом количестве воды.

2) иметь оптимальную концентрацию водородных ионов - рЌ, так как только при оптимальной реакции среды, вли€ющей на проницаемость оболочки, микроорганизмы могут усваивать питательные вещества.

ƒл€ большинства патогенных бактерий оптимальна слабощелочна€ среда (рЌ 7,2-7,4). »сключение составл€ют холерный вибрион - его оптимум находитс€ в щелочной зоне (рЌ 8,5-9,0) и возбудитель туберкулеза, нуждающийс€ в слабокислой реакции (рЌ 6,2-6,8).

„тобы во врем€ роста микроорганизмов кислые или щелочные продукты их жизнеде€тельности не изменили рЌ, среды должны обладать буферностью, т. е. содержать вещества, нейтрализующие продукты; обмена;

3) быть изотоничными дл€ микробной клетки; т. е. осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки. ƒл€ большинства микроорганизмов оптимальна среда, соответствующа€ 0,5% раствору натри€ хлорида;

4) быть стерильными, так как посторонние микробы преп€тствуют росту изучаемого микроба, определению его свойств и измен€ют свойства среды (состав, рЌ и др.);

5) плотные среды должны быть влажными и иметь оптимальную дл€ микроорганизмов консистенцию;

6) обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом, т. е. соотношением веществ, отдающих и принимающих электроны, выражаемым индексом RH2. Ётот потенциал показывает насыщение среды кислородом. ƒл€ одних микроорганизмов нужен высокий потенциал, дл€ других - низкий. Ќапример, анаэробы размножаютс€ при RH2 не выше 5, а аэробы - при RH2 не ниже 10. ќкислительно-восстановительный потенциал большинства сред удовлетвор€ет требовани€м к нему аэробов и факультативных анаэробов;

7) быть по возможности унифицированным, т. е. содержать посто€нные количества отдельных ингредиентов. “ак, среды дл€ культивировани€ большинства патогенных бактерий должны содержать 0,8-1,2 г/л аминного азота NH2, т. е. суммарного азота аминогрупп аминокислот и низших полипептидов; 2,5-3,0 г/л общего азота N; 0,5% хлоридов в пересчете на натри€ хлорид; 1% пептона.

∆елательно, чтобы среды были прозрачными - удобнее следить за ростом культур, легче заметить загр€знение среды посторонними микроорганизмами.

 лассификаци€ сред

ѕотребность в питательных веществах и свойствах среды у разных видов микроорганизмов неодинакова. Ёто исключает возможность создани€ универсальной среды.  роме того, на выбор той или иной среды вли€ют цели исследовани€.

¬ насто€щее врем€ предложено огромное количество сред* в основу классификации которых положены следующие признаки.

1. »сходные компоненты. ѕо исходным компонентам различают натуральные и синтетические среды. Ќатуральные среды готов€т из продуктов животного и растительного происхождени€. ¬ насто€щее; врем€ разработаны среды, в которых ценные пищевые продукты (м€со и др.) заменены непищевыми: костной и рыбной мукой, кормовыми дрожжами, сгустками крови и др. Ќесмотр€ на то что состав питательных сред из натуральных продуктов очень сложен и мен€етс€ в зависимости от исходного сырь€, эти среды нашли широкое применение. —интетические среды готов€т из определенных химически чистых органических и неорганических соединений, вз€тых в точно указанных концентраци€х и растворенных в дважды дистиллированной воде. ¬ажное преимущество этих сред в том, что состав их посто€нен (известно, сколько и какие вещества в них вход€т), поэтому эти среды легко воспроизводимы.

2.  онсистенци€ (степень плотности). —реды бывают жидкие, плотные и полужидкие. ѕлотные и полужидкие среды готов€т из жидких, к которым дл€ получени€ среды нужной консистенции прибавл€ют обычно агар-агар или желатин.

јгар-агар - полисахарид, получаемый из определенных сортов морских водорослей. ќн не €вл€етс€ дл€ микроорганизмов питательным веществом и служит только дл€ уплотнени€ среды. ¬ воде агар плавитс€ при 80-100∞ —, застывает при 40-45∞ —.

∆елатин - белок животного происхождени€. ѕри 25-30∞ — желатиновые среды плав€тс€, поэтому культуры на них обычно выращивают при комнатной температуре. ѕлотность этих сред при рЌ ниже 6,0 и выше 7,0 уменьшаетс€, и они плохо застывают. Ќекоторые микроорганизмы используют желатин как питательное вещество - при их росте среда разжижаетс€.

 роме того, в качестве плотных сред примен€ют свернутую сыворотку крови, свернутые €йца, картофель, среды с селикагелем.

3. —остав. —реды дел€т на простые и сложные.   первым относ€т м€сопептонный бульон (ћѕЅ), м€сопептонный агар (ћѕј), бульон и агар ’оттингера, питательный желатин и пептонную воду. —ложные среды готов€т, прибавл€€ к простым средам кровь, сыворотку, углеводы и другие вещества, необходимые дл€ размножени€ того или иного микроорганизма.

4. Ќазначение: а) основные (общеупотребительные) среды служат дл€ культивировани€ большинства патогенных микробов. Ёто вышеупом€нутые ћѕј, ћѕЅ, бульон и агар ’оттингера, пептонна€ вода;

б) специальные среды служат дл€ выделени€ и выращивани€ микроорганизмов, не растущих на простых средах. Ќапример, дл€ культивировани€ стрептококка к средам прибавл€ют сахар, дл€ пневмо- и менингококков - сыворотку крови, дл€ возбудител€ коклюша - кровь;

в) элективные (избирательные) среды служат дл€ выделени€ определенного вида микробов, росту которых они благопри€тствуют, задержива€ или подавл€€ рост сопутствующих микроорганизмов. “ак, соли желчных кислот, подавл€€ рост кишечной палочки, делают среду элективной дл€ возбудител€ брюшного тифа. —реды станов€тс€ элективными при добавлении к ним определенных антибиотиков, солей, изменении рЌ.

∆идкие элективные среды называют средами накоплени€. ѕримером такой среды служит пептонна€ вода с рЌ 8,0. ѕри таком рЌ на ней активно размножаетс€ холерный вибрион, а другие микроорганизмы не растут;

г) дифференциально-диагностические среды позвол€ют отличить (дифференцировать) один вид микробов от другого по ферментативной активности, например среды √исса с углеводами и индикатором. ѕри росте микроорганизмов, расщепл€ющих углеводы, измен€етс€ цвет среды;

д) консервирующие среды предназначены дл€ первичного посева и транспортировки исследуемого материала; в них предотвращаетс€ отмирание патогенных микроорганизмов и подавл€етс€ развитие сапрофитов. ѕример такой среды - глицеринова€ смесь, используема€ дл€ сбора испражнений при исследовани€х, проводимых с целью обнаружени€ р€да кишечных бактерий.

–ецепты приготовлени€ некоторых сред приведены в конце следующего раздела и во второй части учебника.

 онтрольные вопросы

1.  аким требовани€м должны удовлетвор€ть питательные среды?

2.  ак классифицируют среды по исходным компонентам?

3.  акие вещества служат дл€ уплотнени€ сред?

4.  акие среды €вл€ютс€ простыми или общеупотребительными и дл€ чего их примен€ют?

5.  акие среды называют сложными, что служит их основой?

6.  акие среды позвол€ют получить преимущественный рост одних микробов при одновременном подавлении других?

7. Ќа каких средах изучают ферментативную активность микробов?

«адание

«аполните форму, указав на какие группы подраздел€ют среды.

ѕриготовление сред

ѕосуда дл€ приготовлени€ сред не должна содержать посторонних веществ, например щелочей, выдел€емых некоторыми сортами стекла, или окислов железа, которые могут попасть в среду при варке ее в ржавых кастрюл€х. Ћучше всего пользоватьс€ стекл€нной, эмалированной или алюминиевой посудой. Ѕольшие количества среды (дес€тки и сотни литров) готов€т в специальных варочных котлах или реакторах (рис. 14). ѕеред употреблением посуду необходимо тщательно вымыть, прополоскать и высушить. Ќовую стекл€нную посуду предварительно кип€т€т 30 мин в 1-2% растворе хлороводородной кислоты или погружают в этот раствор на ночь, после чего в течение часа прополаскивают в проточной воде.


–ис. 14. ќбщий вид реактора

¬нимание! ѕосудой, предназначенной дл€ приготовлени€ сред, нельз€ пользоватьс€ в других цел€х, например дл€ хранени€ химических реактивов или дезинфицирующих растворов - даже следы этих веществ могут помешать росту микроорганизмов.

»сходным сырьем дл€ приготовлени€ большинства сред служат продукты животного или растительного происхождени€: м€со и его заменители, молоко, €йца, картофель, со€, кукуруза, дрожжи и др.

ќсновные питательные бульоны готов€т на м€сной воде или на различных переварах, полученных при кислотном или ферментативном гидролизе исходного сырь€. Ѕульоны из переваров в 5-10 раз экономичнее, чем из м€сной воды. —реды на переварах богаче аминокислотами, следовательно, питательнее; обладают большей буферностью, т. е. имеют более стабильную величину рЌ.  роме того, перевары можно готовить из заменителей м€са (сгустков крови, плаценты, казеина и т. д.).

¬ насто€щее врем€ снабжение лабораторий м€сной водой и переварами централизованно. „аще пользуютс€ панкреатическим переваром ’оттингера, гидролизатами казеина или кормовых дрожжей. »з этих полуфабрикатов по определенным рецептам готов€т необходимые среды.

Ётапы приготовлени€ сред: 1) варка; 2) установление оптимальной величины рЌ; 3) осветление; 4) фильтраци€; 5) разлив; 6) стерилизаци€; 7) контроль.

¬ар€т среды на открытом огне, вод€ной бане, в автоклаве или варочных котлах, подогреваемых паром.

”становление рЌ сред ориентировочно производ€т с помощью индикаторных бумажек. ƒл€ точного определени€ рЌ пользуютс€ потенциометром, примен€€ стекл€нные электроды в соответствии с инструкцией или компаратором (аппарат ћихаэлиса), состо€щим из штатива с гнездами дл€ пробирок (рис. 15) и набора стандартов определенного рЌ. ѕри приготовлении сред пользуютс€ обычно индикатором метанитрофенолом, измен€ющим свой цвет в диапазоне 6,8-8,4.


–ис. 15.  омпаратор (аппарат макро-ћихаэлиса). 1 - вид спереди; 2 - вид сзади; 3 - схема расположени€ пробирок в штативе

ƒл€ определени€ рЌ среды 4 пробирки, диаметр и цвет стекла которых не отличаетс€ от пробирок со стандартами, помещают в гнезда 1, 2, 3 и 5 (см. рис. 15). ¬ 1-ю и 3-ю пробирки наливают по 5 мл дистиллированной воды; в 5-ю - 7 мл; во 2-ю - 4 мл воды и 1 мл индикатора. ¬ гнезда 4 и 6 став€т стандарты нужного рЌ. ¬ 1-ю, 2-ю и 3-ю пробирки наливают 2 мл охлажденной среды. —одержимое пробирок смешивают.

÷вет жидкостей в пробирках сравнивают в проход€щем свете, закрыв заднюю прорезь прибора фильтром (матовым или синим, если жидкости интенсивно желтые). рЌ испытуемого раствора соответствует рЌ стандарта, с цветом которого совпадает его цвет.

√отов€ среды с заданным рЌ, в гнезде 4 и 6 став€т стандарты, рЌ которых близок к требуемому, а во 2-ю пробирку с испытуемой средой и индикатором добавл€ют из бюретки определенное количество раствора щелочи, если жидкость во 2-й пробирке светлее стандартов, или раствора кислоты - если светлее стандарты. ўелочь (или кислоту) приливают до тех пор, пока цвет жидкости во 2-й пробирке не совпадает с цветом стандартов.  оличество щелочи (или кислоты), прибавленное к 2 мл среды во 2-й пробирке, пересчитывают на весь объем приготовленной среды. Ќапример, если дл€ получени€ нужного рЌ на 2 мл среды пошло 2 капли (0,1 мл) 0,05 н. раствора щелочи, то дл€ подщелачивани€ 1 л нужно в 500 раз больше, т. е. 50 мл 0,05 н. или 2,5 мл 1 н. раствора щелочи.

ѕри стерилизации рЌ сред снижаетс€ на 0,2, поэтому дл€ получени€ среды с рЌ 7,2-7,4 ее сначала готов€т с рЌ 7,4-7,6.

ќсветление сред производ€т, если при варке они мутнеют или темнеют. ƒл€ осветлени€ в среду, подогретую до 50∞ —, вливают белок куриного €йца, взбитый с двойным количеством воды, перемешивают и кип€т€т. —вертыва€сь, белок увлекает в осадок взвешенные в среде частицы. “аким же способом можно вместо €ичного белка использовать сыворотку крови (20-30 мл на 1 л среды).

‘ильтрацию жидких и расплавленных желатиновых сред производ€т через влажный бумажный или через матерчатые фильтры. ‘ильтраци€ агаровых сред затруднена, - они быстро застывают. ќбычно их фильтруют через ватно-марлевый фильтр (в воронку помещают марлевую салфетку и на нее пышный комок ваты). ћожно пользоватьс€ бумажными или матерчатыми фильтрами, если проводить фильтрацию в гор€чем автоклаве или в воронках с подогревом.

‘ильтрацию агаровых сред можно заменить отстаиванием. —реду наливают в высокий цилиндрический сосуд и расплавл€ют в автоклаве. ѕри медленном остывании среды в выключенном приборе взвешенные в ней частицы оседают на дно. Ќа следующий день агаровый сгусток извлекают из сосуда (дл€ этого сосуд ненадолго помещают в гор€чую воду) и отрезают ножом нижнюю часть со скопившимс€ осадком. ¬ерхнюю часть растапливают и разливают в соответствующие емкости.

–азливают среды в пробирки (по 3-5 мл или по 10 мл), флаконы, колбы, матрацы и бутылки не более чем на 2/3 емкости, так как при стерилизации могут намокнуть пробки и среды утрат€т стерильность.

—реды, которые стерилизуют при температуре выше 100∞ —, разливают в чистую сухую посуду. —реды, стерилизуемые при более низкой температуре, об€зательно разливают в стерильную посуду.

–азливают среды с помощью воронки, на конец которой надета резинова€ трубка с зажимом ћора. ƒл€ мерного разлива примен€ют мензурки, бюретки, дозаторы, шприцы-пипетки и т. п. (рис. 16).


–ис. 16. ѕриспособлени€ дл€ мерного разлива сред. а - лабораторный монтаж; б - автоматический шприц-пипетка; в - дозатор; г - полуавтомат; д - автоматический дозатор

ѕосуду со средой обычно закрывают ватно-марлевыми пробками, поверх которых надевают бумажные колпачки. ¬ажно, чтобы при разливе среда не смачивала кра€ посуды, иначе к ним могут прилипнуть пробки.   каждому сосуду об€зательно прикрепл€ют этикетку с названием среды и датой ее приготовлени€.

—терилизаци€. –ежим стерилизации зависит от состава среды и указан в ее рецепте. ѕримерна€ схема режима стерилизации сред приведена в табл. 8.


“аблица 8. –ежим стерилизации сред

1 (∆идкие среды с углеводами, белками или витаминами лучше стерилизовать с помощью бактериальных фильтров.)

 онтроль готовых сред: а) дл€ контрол€ стерильности среды став€т в термостат на 2 сут, после чего просматривают. ≈сли на средах не по€в€тс€ признаки роста, их считают стерильными и передают дл€ химического контрол€ по нескольку образцов каждой серии; б) химический контроль: окончательно устанавливают рЌ, содержание общего и аминного азота, пептона, хлоридов (их количество должно соответствовать указанному в рецепте).

’имический контроль сред производ€т в химической лаборатории; в) дл€ биологического контрол€ несколько образцов среды засевают специально подобранными культурами микроорганизмов, и по их росту суд€т о питательных (ростовых) свойствах среды.   готовой среде прилагают этикетку и паспорт, в котором указывают название и состав среды, результаты контрол€ и др.

’ран€т среды при комнатной температуре в шкафах, желательно специально дл€ них предназначенных. Ќекоторые среды, например, среды с кровью и витаминами, хран€т в холодильнике.





ѕоделитьс€ с друзь€ми:


ƒата добавлени€: 2016-11-22; ћы поможем в написании ваших работ!; просмотров: 1204 | Ќарушение авторских прав


ѕоиск на сайте:

Ћучшие изречени€:

Ѕутерброд по-студенчески - кусок черного хлеба, а на него кусок белого. © Ќеизвестно
==> читать все изречени€...

1622 - | 1584 -


© 2015-2024 lektsii.org -  онтакты - ѕоследнее добавление

√ен: 0.02 с.