Взятие и доставка в лабораторию проб фекалий

Рукой в резиновой перчатке берут примерно 100 г фекалий из прямой кишки животных или только что выделившихся при испражнении. В последнем случае берут пробу с верхней части экскрементов, не соприкасавшейся с полом или почвой. Руку и пинцет после взятия каждой пробы тщательно моют. Пробы от мелких животных берут с помощью груши. Вращательными движениями наконечник груши вводят в прямую кишку. При сдавливании груши воздух входит в кишку. Затем наконечник груши вынимают. Эта манипуляция вызывает рефлекторный акт дефекации. После каждого взятия пробы наконечник груши тщательно промывают. Взятый материал регистрируют в описи сопроводительного документа.

Каждую пробу помещают в пакетик из плотной бумаги или целлофановый, нумеруют и отправляют в лабораторию с описью в сопроводительном документе. В нем указывают хозяйство, отделение или владельца животных, вид и количество их в стаде (отаре, табуне), дату взятия проб и цель исследования.

В лабораторию отправляют пробы не более суточной давности со времени их взятия. При исследовании на диктиокаулез и стронгилоидоз пробы следует доставлять в лабораторию не позже чем через 4 ч после взятия.

Если нет возможности своевременно доставить пробы в лабораторию, их можно консервировать, используя для этой цели физические и химические методы консервации.

Из физических методов наиболее распространенным и простым является воздействие низких температур. Пробы помещают в холодильник при температуре +2…-4°С, что задерживает развитие личинок.

Можно использовать и различные химические средства:

ü жидкость Барбагалло (3%-ный раствор формалина в изотоническом растворе натрия хлорида). В ней пробы фекалий могут сохраняться до двух недель;

ü смесь, состоящую из формалина (5 мл), глицерина (5 мл) и воды (100 мл);

ü смесь, состоящую из 0,2%-ного натрия азотнокислого (1900 мл), раствора Люголя (250 мл), формалина (300 мл) и глицерина (25 мл).

Гельминтоскопия

Для обнаружения гельминтов в фекалиях их смешивают с водой (1:10) и смеси дают отстояться. Через некоторое время (не менее 5 мин) верхний слой воды сливают, а к осадку приливают новую порцию воды. Так повторяют несколько раз, что позволяет удалить большую часть посторонних веществ, а в осадке остаются паразиты и нерастворимые тяжелые части фекалий. Затем осадок исследуют макро- и микроскопически.

Макроскопическое исследование. Промытый осадок фекалий вновь разбавляют водой, небольшими порциями наливают в черную кювету и при медленном покачивании ее внимательно просматривают осадок. Можно брать осадок небольшими порциями, выливать в чашки Петри и просматривать под лупой или микроскопом. Некоторых гельминтов лучше просматривать на белом фоне. Поэтому рекомендуют одну половину кюветы окрашивать в черный цвет, другую – в белый. Так последовательно просматривают весь материал. Обнаруженных паразитов выбирают препаровальной иглой или кисточкой и фиксируют.

Микроскопическое исследование. Для обнаружения мелких форм паразитов отмытый осадок исследуют в бактериологических чашках с помощью штативной лупы (6-10-кратное увеличение).

Гельминтоовоскопия

Оборудование и средства. Для проведения гельминтоовоскопии необходимо следующее оборудование и материалы: микроскоп биологический (МБИ) или микроскоп биологический стереоскопический (МБС), предметные и покровные стекла, бактериологические чашки, пинцеты, ножницы, стеклянные палочки, фарфоровые ступки и пестики, стаканчики из стекла или синтетического материала с верхним диаметром 4-5 см (мензурки в форме усеченного конуса на 50 мл), можно использовать баночки Флоринского, ситечки с металлической или покровной сеткой (кусочки чулочной ткани или марли) с величиной сторон ячеек 0,25-0,3 мм, центрифужные пробирки, центрифуга до 2 тыс. об/мин, металлические петли с диаметром кольца 5-8 мм, спиртовая или газовая горелка, флотационные растворы, десенсиметр для проверки плотности флотационных растворов, глицерин, молочная кислота, глазные пипетки, целлофановая пленка.

Приготовление флотационных растворов. Насыщенный раствор натрия хлорида (NaCl). В эмалированное ведро с кипящей водой порциями кладут соль, постоянно помешивая деревянной лопаточкой до полного растворения. Соль добавляют до тех пор, пока она не начинает выпадать в осадок. Для приготовления раствора требуется 420 г соли на 1 л воды. В горячем виде раствор фильтруют через марлю. При остывании раствора кристаллы хлорида натрия выпадают в осадок, что свидетельствует о плотности насыщенного раствора, равной 1,18-1,20.

Раствор свинца нитрата (азотнокислого свинца) (Pb(NO₃)₂). Соль растворяют в горячей воде порциями при подогревании и постоянном помешивании до полного растворения. На 1 л воды требуется 650 г соли. Фильтровать раствор не обязательно. Плотность насыщенного раствора 1,5. Он обладает высокой флотационной способностью. Однако уже через 24 ч после приготовления плотность несколько падает за счет выпадения частиц соли в осадок. Поэтому перед употреблением раствор подогревают с размешиванием осадка. Плотность уточняют десенсиметром.

Нитрат свинца – соль тяжелого металла, при работе с ним следует соблюдать осторожность.

Раствор аммония нитрата (NH₄NО₃) готовят так же, как и предыдущий раствор. На 1 л воды расходуют 1500 г гранулированного порошка аммониевой селитры. Плотность раствора нитрата аммония должна быть 1,5.

Раствор натрия нитрата (NaNO₃) готовят путем добавления на 1 л воды 1 кг азотнокислого натрия. Плотность раствора равна 1,38-1,40.

Раствор цинка сульфата (ZnSO₄∙7H₂O) приготавливают при добавлении на 1 л воды 400 г сернокислого цинка. Его плотность равна 1,24.

Раствор натрия тиосульфата (Nа₂S₂О₃∙5Н₂О) с плотностью 1,4 готовят путем добавления к 1л воды 1750 г вещества.

Раствор магния сульфата (MgSO₄) с плотностью 1,26-1,28 готовят путем добавления 920 г соли yа 1 л воды.

Методы седиментации

Метод последовательных промываний применяют для диагностики трематодозов. Пробу фекалий (3-5 г) кладут в стаканчик или фарфоровую ступку, заливают небольшим количеством воды и, размешивая стеклянной палочкой (в ступке пестиком), добавляют воду до 50-100 мл. Смесь фильтруют через ситечко или марлю (1 слой) и отстаивают 3-5 мин. Затем верхний слой сливают, а к осадку добавляют такое же количество воды и процедуру повторяют до тех пор, пока надосадочный слой не будет прозрачным. Верхний слой сливают, а осадок порциями разливают в чашки Петри или на предметное стекло и микроскопируют.

Модификация метода по Т.Г. Никулину. Учитывая, что при последовательном сливании надосадочной жидкости происходит взмучивание, осадок и часть яиц трематод могут быть слиты. Т.Г. Никулин предложил отсасывать надосадочную жидкость грушей. При массовых исследованиях на наконечник груши надевают кружок из картона (ограничитель). Поскольку во всех пробах в стаканчиках остается одинаковое количество осадка и он не взмучивается, результаты исследований являются более достоверными.

Метод седиментации с целлофановыми пленками по Г.А. Котельникову и В.М. Хренову предложен для диагностики фасциолеза и дикроцелиоза жвачных, аскариоза и трихоцефалеза свиней. Из гидрофильного целлофана толщиной 22 мкм нарезают прямоугольные кусочки 2x3 см и помещают их на 24 ч в бактериологическую чашку с 50%-ным раствором молочной кислоты или глицерина на одни сутки.

После приготовления целлофановых пленок берут пробу фекалий массой 2 г и размешивают в стаканчике с небольшим количеством воды. Взвесь фильтруют через металлическое ситечко или марлю (1 слой) в чистый стакан емкостью 50 мл, отстаивают 15 мин, сливают надосадочную жидкость, а к осадку добавляют 35-40 мл водопроводной воды, опять отстаивают 5 мин, надосадочную жидкость сливают, осадок переносят на предметное стекло и покрывают целлофановой пленкой. Через 8-10 мин проводят микроскопию препарата. Раствор молочной кислоты или глицерина просветляет препарат, а пленка предохраняет его от высыхания.

Флотационно-седиментационный метод Н.В. Демидова применяют для диагностики фасциолеза. Пробу фекалий (от крупного рогатого скота – 5 г, от овец – 3 г) помещают в большой стакан, заливают доверху насыщенным раствором натрия хлорида и тщательно размешивают стеклянной палочкой до получения равномерной взвеси. Взвесь отстаивают 15-20 мин, затем чайной ложечкой или совочком удаляют всплывшие па поверхность грубые частицы. Жидкость отсасывают грушей (при массовом исследовании допускается сливание), оставляя 20-30 мл ее над осадком, к осадку доливают воду до полного объема стакана и тщательно размешивают палочкой. Взвесь фильтруют в большие стаканы, фильтрат отстаивают в течение 5 мин (для фильтрации используют марлю или металлическое ситечко с ячейками 0,25 мм), жидкость из стаканов отсасывают, оставляя на дне 15-20 мл осадка. Осадок перемешивают в конических стаканчиках, большие стаканы прополаскивают водой и выливают, смыв в маленькие, взвесь отстаивают в конических стаканчиках 3-5 мин, а жидкость отсасывают. Эту процедуру повторяют до просветления надосадочной жидкости, затем осадок переносят на предметное стекло и микроскопируют.

Методы флотации

Метод Фюллеборна. В стакане емкостью 200 мл размешивают 8-10 г свежих фекалий с 20-кратным объемом насыщенного раствора натрия хлорида. После тщательного размешивания смесь фильтруют через металлическое или капроновое ситечко (можно через марлю) в другой чистый стакан емкостью 100 мл и оставляют на 45-60 мин. Затем проволочной петлей с поверхности взвеси берут 3-6 капель и наносят на хорошо обезжиренное предметное стекло, покрывают покровным стеклом и микроскопируют.

Метод Дарлинга. Пробу свежих фекалий массой 5 г смешивают в стакане с водой в соотношении 1:10 и через ситечко или марлю процеживают в другой чистый стакан. Фильтрат отстаивают 5 мин, верхний слой жидкости сливают, не взмучивая осадка, а осадок с небольшим количеством оставшейся жидкости (10 мл) переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 2 мин при скорости 1500 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, а к осадку приливают жидкость Дарлиига (глицерин, смешанный в равных частях с насыщенным раствором хлорида натрия). Пробирку встряхивают или размешивают палочкой, чтобы осадок смешался с флотационной жидкостью, повторно центрифугируют в течение 2 мин при скорости 1500 об/мин. При наличии в пробе фекалий яиц гельминтов они всплывают на поверхность жидкости в центрифужной пробирке. Гельминтологической петлей берут 3-4 капли с поверхности взвеси, наносят на предметное стекло и микроскопируют.

Метод И.А. Щербовича выполняют по такой же методике, как и Дарлинга, но в качестве флотационной жидкости используют насыщенные растворы натрия гипосульфита или магния сульфата. Поскольку плотность указанных растворов выше, чем плотность жидкости Дарлинга, метод Щербовича используют для диагностики гельминтозов, яйца возбудителей которых имеют больший удельный вес (метастронгилез свиней, трихоцефалез, макраканторинхоз и др.).

Метод Г.А. Котельникова и В.М. Хренова наиболее эффективен при диагностике нематодозов, эймериозов и других паразитозов животных. Он выполняется в двух вариантах.

Суть первого варианта состоит в том, что пробу фекалий массой 3 г кладут в стаканчик, добавляют раствор аммиачной селитры и тщательно размешивают стеклянной палочкой. Затем порциями доливают раствор соли до 50 мл. Полученную взвесь фильтруют через металлическое или капроновое ситечко в другой стаканчик и дают отстояться в течение 10 мин. При диагностике стронгилятозов достаточно, чтобы взвесь отстоялась в течение 3-5 мин. После этого гельминтологической петлей с поверхности взвеси снимают 3-6 капель с разных мест, переносят их на предметное стекло и микроскопируют.

Второй вариант – метод флотации с аммиачной селитрой и с центрифугированием – это модификация метода Дарлинга при использовании в качестве флотационной жидкости насыщенного раствора аммиачной селитры. Он оказывается очень эффективным при диагностике ряда цестодозов, аскаридатозов, стронгилятозов и других паразитов.

Гельминтоларвоскопия

Оборудование и средства. Термостат, центрифуга, микроскоп биологический (МБИ) или микроскоп биологический стереоскопический (МБС), аппарат Бермана, чашки бактериологические, баночки Флоринского, часовые и предметные стекла, пипетки глазные, марля, вата, 0,1%-ный водный раствор метиленового синего, насыщенный раствор цинка сульфата, центрифужные пробирки, пинцеты, ножнички, топкая мягкая проволока, конические стаканчики, стеклянные палочки, раствор Люголя.

Метод Бермана. Пробы свежих фекалий (10 г) помещают завернутыми в марлю или на металлическую сетку в воронку аппарата Бермана. Предварительно резиновую трубку, присоединенную к воронке, закрывают зажимом и в воронку заливают воду комнатной температуры (35-38°С). Фекалии мелких жвачных оставляют в воронке на 4-6 ч, крупного рогатого скота и лошадей – на 10-12 ч. За это время личинки диктиокаулюсов выползают из пробы фекалий в воду и постепенно опускаются по трубке вниз к зажиму. По истечении указанного времени зажим открывают и жидкость из нижней части трубки осторожно сливают в бактериологическую чашку и исследуют под микроскопом.

Метод Бермана-Орлова является модификацией метода Бермана. В аппарате Бермана на конец резиновой трубки зажим не устанавливают, а плотно присоединяют пробирку. При помещении в воронку с теплой водой фекалий личинки гельминтов оседают на дно пробирки. По истечении необходимого срока (для мелкого рогатого скота – 4-6 ч, для крупного рогатого скота и лошадей – 10-12 ч) пробирку отсоединяют от резиновой трубки, жидкость аккуратно сливают или отсасывают пипеткой, а осадок помещают на предметное стекло или чашку Петри и микроскопируют.

Метод И.А. Щербовича. Пробу фекалий (8-10 г) помещают на кусочек марли, концы которой закручивают тонкой мягкой проволокой и подвешивают в стакан с водой температурой 35-38°С. Пробы фекалий мелких животных и лошадей выдерживают в течение 3 ч, крупного рогатого скота – 12 ч. Затем пробу фекалий из стакана извлекают, воду осторожно (не взболтать) сливают, осадок помещают в центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 1 мин со скоростью 1000 об/мин. Надосадочную жидкость в пробирке сливают, осадок переносят на предметное стекло и микроскопируют.

Метод Вайда. На предметное или часовое стекло кладут несколько шариков свежевыделенных фекалий овец или коз и добавляют небольшое количество воды температурой около 40°С. Если шарики помещают на предметное стекло, достаточно нескольких капель воды. Через 40 мин шарики удаляют, оставшуюся жидкость на стекле исследуют под микроскопом па наличие личинок. Методика эффективна при условии, если фекалии плотные. Применяют для диагностики диктиокаулеза, мюллериоза, протостронгилеза, цистокаулеза овец и коз.

Флотация с раствором цинка сульфата – избирательный экспресс-метод диагностики диктиокаулеза по Котельникову и Хренову. Пробы фекалий (по 5 г) овец и коз кладут в стаканчик с раствором цинка сульфата, в течение 1-2 мин энергично разгоняют по кругу, не растирая и не размешивая. Не менее чем через 5-10 мин пробы вынимают пинцетом, взвесь оставляют на 10-15 мин. Затем металлической петлей снимают 6 капель с поверхности жидкости, переносят на предметное стекло и микроскопируют.

Пробы от овец полужидкой консистенции и пробы от телят (5 г) также помещают в стаканчики с раствором цинка сульфата и выдерживают 20-30 мин без разгонки и размешивания. Затем фекалии удаляют, через несколько минут снимают металлической петлей 6 капель с поверхности пленки и микроскопируют. Личинки диктиокаулюсов в поверхностной пленке сохраняют подвижность до 3 ч. Метод обладает избирательностью в отношении личинок диктиокаулюсов. Личинки стронгилят пищеварительного тракта и стронгилоидов деформируются и разрушаются в течение 1-2 мин, личинки мюллериусов свертываются спирально и напоминают пузырьки воздуха.