Методы иммуноферментного анализа в диагностике

Болезней животных

(Холод В.М., Мацинович А.А.)

Иммуноферментный анализ (ИФА) – относится к группе иммунохимических методов биохимического исследования. Метод основан на специфическом взаимодействии антитела (ат) с антигеном (аг) – специфические компоненты реакции. В разных вариантах постановки метода АГ или АТ, помечается так называемой ферментной меткой. Последняя представляет собой очищенный фермент высокой активности, присоединенный посредством физико-химического взаимодействия к молекуле ат или аг. Фермент используется для визуализации иммунного взаимодействия. На последнем этапе постановки реакции добавляется субстрат, на который воздействует фермент с образованием специфического продукта. Еще одним принципиальным условием постановки метода является отделение, образующегося иммунного комплекса от других составляющих реакционной среды. Это достигается, как правило, адсорбцией одного из специфических компонентов реакции на каком-то носителе (чаще всего на материале из которого изготовлена емкость, в которой ставится реакция). Затем посредством отмывания от мешающих компонентов в реакционной среде остается только искомый иммунный комплекс, с ферментной меткой к которому добавляется субстрат.

Теоретически метод основывается на одном из фундаментальных законов химии - законе действия масс. Применительно к данному методу используется частный вывод из закона – количество меченого антигена, связавшегося с антителами будет обратно пропорционально количеству определяемого антигена:

[А_г–А_т]

А_г+А_т=А_г–А_т; К = ¾¾¾¾¾¾, где

[А_г]*[А_т]

К- константа равновесия обратимой реакции,

[А_г] - концентрация антигена;

[А_т] - концентрация антитела;

[А_г–А_т] - концентрация комплекса антиген-антитело.

 

В состоянии равновесия отношение связанного антигена (В) к свободному (F) определяется соотношением:

 

В/F= [Аг*Ат ]/[Аг_исх]- [Аг_св ], где

 

[Аг_исх] - исходная концентрация антигена;

[Аг_св ] - количество антигена, связанного в виде комплекса Аг*Ат.

 

Меченый антиген ведет себя так же, как и немеченый, и отношение концентрации связанного антигена и свободного описывается тем же уравнением.

Отсюда следует, что если концентрация немеченого антигена Аг (определяемого агента) будет увеличена при постоянной концентрации меченого антигена (Аг), то первый связывает большее число антител. В результате концентрация связанного меченого антигена (Аг^х Ат) снизится и отношение связанного меченого антигена к свободному (В^х/F^х) будет уменьшаться с увеличением в инкубационной смеси немеченого (определяемого) антигена. Поэтому отношение В^х/F^x является количественной характеристикой определяемого антигена.

Метод ИФА является историческим продолжением радиоиммунологического метода (РИА) широко используемого для определения концентрации гормонов и до настоящего времени. Методы ИФА были разработаны в начале 70-х годов ХХ века. Метод иммуноферментного анализа имел ряд преимуществ перед методом радиоиммунологического анализа.

1. В нем не использовались радиоактивные изотопы. Отсутствие радиационной опасности значительно упрощает условия проведения реакции.

2. Меченые соединения, используемые в ИФА более устойчивы и постоянны (в РИА они устойчивость зависит от периода полураспада изотопов.)

3. Возможность быстрого определения результатов ферментативной реакции с помощью обычных общедоступных приборов (фотометров). Возможность даже визуальной оценки реакции.

4. ИФА легко поддается автоматизации.

Чувствительность и специфичность ИФА определяется качеством иммунной сыворотки. Необходимо использовать только высокоавидные и высоко специфические антитела. В настоящее время качественный иммуноферментный диагностикум должен изготавливаться на основе моноклональных Ат.

Принципиально следует разделять методы ИФА на вида: конкурентный ИФА и неконкурентный ИФА. В первом случае в реакционную смесь вносят заранее известное количество меченого Аг или Ат, которые в соответствие с законом действия масс конкурируют за специфическое взаимодействие с Аг или Ат, находящимся в исследуемом материале. При неконкурентном методе происходит отделение продукта специфической иммунной реакции - комплекса Аг-Ат и проведение последующей специфической реакции с меченным Ат к этому комплексу. Конкурентный вариант ИФА используется в большей степени для определения концентраций веществ, а неконкурентный метод – это метод полуколичественного определения веществ и расчет концентрации в данном случае проводится по титру или в условных единицах измерения. Неконкурентный вариант ИФА используется для выявления сложных Аг или Ат, с множеством антигенных детерминант, таких возбудители инфекционных заболеваний, или антитела к возбудителям инфекционных и паразитарных заболеваний.

Так же метод ИФА по технике постановки реакции разделяют на гомогенный ИФА (EMJT) в котором образовавшийся при взаимодействии иммунный комплекс не отделяется от других компонентов реакции и твердофазный (ELISA) – в этом случае Аг или Ат иммобилизировано на твердом носителе (пробирке, стенке полистеролловой лунке и т.д.).

Методом ИФА может быть определено любое вещество, которое вступает в специфическое иммунно-химическое взаимодействие и на которое или на образовавшийся иммунный комплекс в организме продуценте иммунных тел развивается иммунитет.

ИФА в ветеринарной практике используют в следующих направлениях.

1. Диагностика инфекционных и паразитарных заболеваний. Она может основываться на определении концентрации Ат к возбудителям заболеваний в сыворотке крови или на определении в органах и тканях Аг (то есть непосредственно возбудителя). Производителями из различных стран выпускается большой спектр диагностикумов для диагностики различных заболеваний крупного рогатого скота, птицы, свиней и др. видов животных. Наиболее распространенными в нашей стране диагностикумами для ИФА являются диагностикумы производства: ФГУ «ВНИИЖЗ» (Россия) – наборы для диагностики инфекционных заболеваний птиц (ИБК, БГ, ИББ, микоплазмоза птиц, сальмонеллеза, ССЯ-76 и др.); Sinbiotic (CША) – так же наборы для диагностики инфекционных заболеваний птиц; AideX (США) - наборы для диагностики инфекционных заболеваний крупного рогатого скота, свиней и птиц (в том числе – для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, классической чумы свиней, РРС); НПФ «Нарвак» - наборы для диагностики инфекционных заболеваний кошек (панлейкемии), - собак (чума собак, инфекционный гепатит и др.), - крупного рогатого скота (вирусной диареи, ИРТ и др.), - свиней (КЧС, РРС, парвовирусной инфекции и др.), - птиц.

2. Гормонодиагностика – определение концентрации гормонов для диагностики эндокринных заболеваний, глубоких нарушений обмена веществ и нарушений воспроизводительной функции. Разработаны методы определения гормонов, как белковой природы, так и стероидной. При этом определяются как основные формы гормонов, так и промежуточные их метаболиты. Наиболее часто в ветеринарной практике определяются концентрация прогестерона, тестостерона, эстрадиола и его метаболитов, трийод- и тетрайодтиронина.

3. Определение остаточных количеств лекарственных препаратов и токсических соединений в животноводческой продукции. Разработаны методы определения антибиотиков и микотоксинов.

4. Определение микотоксинов в кормах для животных с целью определения пригодности к скармливанию. ФГУ «НИИ ветеринарной санитарии» (Россия) разработаны и производятся наборы для определения концентрации микотоксинов (зерааленона, ДОНа, афлатоксинов и др.). Эти наборы широко используются в ветеринарных лабораториях Республики, наставления по их применению утверждены.