Кількісний облік бактерій методом підрахунку на агарових пластинках

Матеріали та обладнання: 1) стерильні чашки Петрі, 2) стерильні колби на 0,5 л, 3) стерильні пробірки і піпетки на 1 мл, 4) 100 г досліджуваного грунту, 5) терези і важки, б) пробірки з стерильним поживним середовищем, 7) водяна баня, 8) електрична плитка, 9) фільтрувальний папір, 10) стерильна вода, 11)вос­кові, олівці, 12) термостат, 13) апарат для підрахунку колоній бактерій, 14) сте­рильні мірні колби на 100 мл.

Основні відомості. Цей метод дослідження мікрофлори грунту за своєю точністю значно поступається перед методами прямого підрахунку бактерій під мікроскопом. Він дає тільки орієнтовні дані переважно про кількість аеробних мікробів у грунті. Проте внаслідок простоти і доступності його дуже часто застосовують у мікробіологічній практиці.

Найкращим поживним середовищем для аеробних гнильних мікроорганізмів грунту є м'ясо-пептонний агар (МПА) і бобово-

¹ Трафарет виготовляють так: заштриховують тушшю 4 см.² на міліметровому папері. Його приклеюють до предметного скла.

Рис. 34. Схема посіву з розбавлень ґрунтової суспензії.

пептонний агар (БПА), що мають слабколужну реакцію. Ці сере­довища при застиганні утворюють агарові пластинки, на яких зруч­но робити кількісний і якісний аналіз колоній. Ще краще застосо­вувати для цієї мети ґрунтовий агар.

Проведення роботи. Беруть певний ґрунтовий зразок, відважу­ють з нього 1 г грунту і роблять серію розведень в стерильній воді для одержання ґрунтової витяжки.

Розведення роблять так: у стерильну мірну колбу на 100 мл вносять 1 г грунту, додають 99 мл. стерильної води і збовтують про­тягом 3 хв. Потім відстоюють 1,5 хв і роблять наступне розведення (схему розведень див. на рис. 34).

Для виготовлення кожної нової концентрації еруть стерильну піпетку.

У три стерильні чашки Петрі обережно виливають по 1 мл ґрун­тової суспензії (розведення 1: 100 000) і розподіляють рівномірне по дну. Далі беруть пробірку з розплавленим поживним середови­щем (температура 40—45° С), виливають у чашку і, обережно по­хитуючи чашкою, перемішують поживне середовище з ґрунтовою суспензією.

Засіяні чашки Петрі позначають і ставлять у термостат при тем­пературі 28° С на три доби. Після цього підраховують (без відкри­вання кришки чашки) кількість колоній, що виросли на агарових пластинках. Якщо на площі чашки Петрі виросло дуже багато колоній, то для полегшення підрахунку її ділять на сектори, або ще краще використовують спеціальний прилад для підрахунку кіль­кості колоній.

Після цього визначають середнє з 3-ох чашок і множать на розведення, взяте для аналізу. Таким способом одержують кількість

¹До 1 л грунтової витяжки додають 0.5 г К₂НРО₄ і 20,2г агару. Середовище стерилізують протягом зохв під тиском 0,5атм. аеробних мікробів в 1 г досліджуваного сирого грунту. Оскільки підрахунки робляться на абсолютно сухий грунт, то для цього треба визначити вологість ґрунтової проби. І тільки після цього одержаний результат, на сирий грунт можна перерахувати на абсо­лютно сухий, поділивши його на наважку абсолютно сухого грунту, що міститься в 1 г сирого грунту.

Приклад. У першій чашці виросло 180 колоній, в другій 190,

а в третій — 230. Тоді в 1 г грунту буде X 100 000 =

= 20 000 000 мікроорганізмів.

Після кількісного аналізу роблять опис культуральних (форма колоній, країв, вигляд центру, поверхні колоній тощо) і морфологіч­них (форма бактерій, здатність до руху, характер розміщення джгутиків, чутливість до фарбування за Грамом тощо) ознак дослі­джуваних мікробів. Студентам, рекомендується описати 3—4 най­характерніші колонії. Всі записи і зарисовки заносять у протоколи робіт.

Дослідження мікрофлори грунту методом пластинок обростання (за М. Г. Холодним)

»

Матеріали та обладнання: 1) мікроскопи, 2) предметні стекла, 3) гострий ніж, 4) спиртівки, 5) стакани на 200 мл, 6) 1%-ний розчин; еритрозину в 5%-ному фенолі, 7) кедрова олія, 8) фільтрувальний папір, 9) ганчірка, 10) вода.

Основні відомості. На відміну від попередніх методів досліджен­ня мікрофлори грунту, які основані на використанні штучних по­живних середовищ, метод пластинок обростання (за М. Г. Холод­ним) дає можливість вивчати цілі мікробні асоціації безпосередньо в грунті, тобто в природному середовищі. За допомогою цього мето­ду можна одержати дані не тільки про склад мікробних асоціацій певного грунту, а й уявлення про відносне багатство грунту мікро­організмами (при порівнянні даних про різні грунти).

Крім методу пластинок обростання М. Г. Холодний розробив і інші методи дослідження мікрофлори грунту, наприклад метод ґрунтових камер і метод пророщування ґрунтового пилу. Ці методи ефективніші, ніж метод пластинок обростання, і знайшли широке застосування в мікробіологічній практиці. Студентам можна реко­мендувати проводити вивчення мікрофлори грунту методом про­рощування ґрунтового пилу, оскільки для методу-ґрунтових камер не завжди можна знайти спеціальну, апаратуру для виготовлення пластинок пресованого грунту.

Проведення роботи. Метод пластинок обростання. На рівній поверхні грунту роблять гострим ножем розріз, глибина якого залежить від досліджуваного ґрунтового горизонту. До верти­кальної стінки зрізу щільно прикладають стерильне знежирене предметне скло. Скло повинно знаходитися в грунті на 2— Зсм нижче від його поверхні. Зверху зріз закривають грунтом. Місце, де встановлено скло, позначають. Витримують скло у грунті залежно від мети досліду 10—15 днів, а інколи й кілька місяців. Після цього обережно ножем знімають землю її виймають скло.

Поверхню скла, що була притулена до стінки ґрунтового розрі­зу, висушують на повітрі і фіксують на полум'ї спиртівки. Проти­лежну сторону витирають сухою ганчіркою. Після фіксації пред­метне скло занурюють в банку з водою верхньою стороною донизу. При цьому великі частинки грунту відмокають і падають на дно, а мікроби та дрібні частинки залишаються на склі. Закінчивши промивання, препарат фарбують еритрозином протягом 30 хв, вису­шують і вивчають під мікроскопом з імерсійною системою.