Тема № 8. Дослідження перетворень амінокислот (трансамінування, дезамінування, декарбоксилування), біосинтезу глутатіону та креатину.

Мета заняття: Вивчити загальні шляхи перетворення амінокислот, оволодіти методами ідентифікації їх метаболітів. Вміти інтерпретувати отримані показники.

Актуальність теми: Обмін білків є центральною ланкою всіх біохімічних процесів, знання і розуміння загальних шляхів перетворень амінокислот, їх метаболітів та визначення активності ферментів, що беруть участь у цих перетворення є критеріями для оцінки обміну білків.

Конкретні завдання:

Ø Визначати активність амінотрансфераз у сироватці крові динітрофенілгідразиновим методом;

Ø Оволодіти методом кількісного визначення креатиніну в сироватці крові;

Ø Давати оцінку проведеним дослідженням і робити висновки про можливість їхнього використання у клінічній практиці.

Теоретичні питання

1. Шляхи утворення та підтримання пулу вільних амінокислот в організмі людини.Загальні шляхи перетворення вільних амінокислот.

2. Трансамінування амінокислот, субстрати для реакцій транс амінування. Механізм реакції трансамінування. Трансамінази. Локалізація трансаміназ в органах і тканинах. Клініко-діагностичне значення визначення активності трансаміназ.

3. Типи реакцій дезамінування амінокислот і їх кінцеві продукти. Механізм окиснювального дезамінування амінокислот. Оксидази L- і D-амінокислот. Їх ферментативна активність, специфічність дії.

4. Декарбоксилування амінокислот. Декарбоксилази. Утворення біогенних амінів (g-аміномасляна кислота, гістамін, серотонін, дофамін). Декарбоксилування амінокислот у процесі гниття білків у кишківнику. Окиснення біогенних амінів.

5. Глутатіон, будова та роль в обміні органічних пероксидів.

6. Утворення креатину та креатиніну, клініко-біохімічне значення порушень їхнього обміну.

Практична робота

Дослід 1. Визначення активності аланінамінотрансферази (АлАТ) уніфікованим динітрофенілгідразиновим методом Райтмана-Френкеля

Принцип методу. В результаті реакції трансамінування під дією АлАТ утворюються піруват і глутамат. При додаванні 2,4-динітрофенілгідразину в лужному середовищі утворюється гідразон піровиноградної кислоти, інтенсивність забарвлення якого прямопропорційна кількості утвореної піровиноградної кислоти і є показником активності АлАТ.

Матеріальне забезпечення: 0,1 М розчинNa₂HPO₄; 0,1 М розчин КН₂РО₄; 0,1 М фосфатний буфер рН 7,4 (змішують 840 мл 0,1 М Na₂HPO₄ і 160 мл 0,1 М КН₂РО₄); 0,4 М розчин NаОН; 0,04 % розчин бромтимолового синього (100 мг індикатора розтирають у ступці з 3,2 мл 0,05 М NаОН, змивають водою в мірну колбу на 250 мл і доводять до мітки водою); субстратний розчин: 29,2 мг α-кетоглутарової кислоти і 1,78 мг D,L-аланіну розчиняють в 1 М NаОН до отримання рН 7,4, розчин переливають у мірну колбу на 100 мл і доводять 0,1 М фосфатним буфером до мітки); 1 М розчин соляної кислоти; 1 мМ розчин 2,4-динітрофенілгідразину (19,8 мг 2,4-динітрофенілгідразину розчиняють у невеликій кількості 1 М НСl при нагріванні на водяній лазні, після охолодження доводять до 100 мл, наступного дня реактив фільтрують); натрію піруват. Визначення проводяться за допомогою спектрофотометра або фотоелектроколориметра. Необхідні термостат або водяна лазня, холодильник.

Приготування калібрувального розчину: 11 мг натрію пірувату розчиняють у невеликій кількості води, переносять у мірну колбу на 100 мл і доводять водою до мітки – 1 мл калібрувального розчину містить 110 мкг натрію пірувату, що відповідає 88 мкг або 1 мкмоль піровиноградної кислоти.

Хід роботи: 1)Дослідна проба: В пробірку вносять 0,5 мл субстратного розчину і 0,1 мл досліджуваної сироватки. Пробірку ставлять у термостат при 37⁰С на 30 хв. Додають 0,5 мл розчину 2,4-динітрофенілгідразину і витримують 20 хв. при кімнатній температурі. Потім додають 5 мл 0,4 М NaOН, перемішують і залишають на 10 хв при кімнатній температурі для розвитку забарвлення. Інтенсивність забарвлення визначають на фотоелектроколориметрі при λ = 546 нм у кюветі з товщиною шару 10 мм проти контрольної проби.

2) Контрольна проба: В пробірку вносять 0,5 мл субстратного розчину, 0,1 мл сироватки і 0,5 мл розчину 2,4-динітрофенілгідразину. Контрольну пробу залишають на 10 хв при кімнатній температурі.

Розрахунок активності АлАТ в сироватці крові проводять за калібрувальним графіком, що показує залежність оптичної густини від вмісту піровиноградної кислоти.

Побудова калібрувального графіка: з калібрувального розчину готують низку розведень (див. табл.). Калібрувальні проби проводять так само як дослідні, але замість сироватки додають розведені калібрувальні розчини. Вимірюють протихолостої проби, в яку замість калібрувальних розчинів додають воду. Визначивши оптичні густини будують калібрувальний графік, відкладаючи на вісі абсцис активність ферменту, а на вісі ординат – значення оптичної густини. Калібрувальна крива лінійна до величини оптичної густини 0,3.