Практическая работа. 1. Изучение мазков риккетсии Провачека, окрашенных фуксином с подогреванием(зарисовать)

1. Изучение мазков риккетсии Провачека, окрашенных фуксином с подогреванием (зарисовать)

Риккетсии, в отличие от бактерий, плохо окрашиваются обычными анилиновыми красителями, поэтому для их окраски используют методы, основанные на протравливании. Риккетсии окрашиваются в красный цвет.

2. Изучение лабораторной диагностика сыпного тифа и других риккетсиозов (составить схему методов диагностики и зарисовать)

Лабораторная диагностика сыпного тифа и других риккетсиозов включает выделение возбудителя, определение его антигенов и ДНК, выявление антител к риккетсиям соответствующих видов. Чаще осуществляется с использованием серологических (РСК, РНГА, РНИФ, ИФА) и молекулярно-генетических (ПЦР, определение нуклеотидных последовательностей фрагментов генов) методов.
Методы выделения и последующей идентификации риккетсий требуют специальной подготовки, соблюдения режимных требований (возбудители 2–3-й группы патогенности).

К возбудителям второй группы патогенности относят R. prowazekii, Coxiella burnetii, R. rickettsii. Их культивирование можно осуществлять в специализированных риккетсиологических лабораториях или лабораториях особо опасных инфекций, что ограничивает возможности использования методов выделения риккетсий в диагностических целях. Выделение возбудителей риккетсиозов от больных наиболее эффективно в острый лихорадочный период, до начала антибиотикотерапии. Основные риккетсиологические методы включают заражение, чаще интраперитонеальное, чувствительных животных (морские свинки, хомячки, хлопковые и белые крысы, белые мыши), развивающихся куриных эмбрионов (в желточный мешок по Коксу), перевиваемых культур клеток (Vero, HeLa, Нер-2, L929), клеток членистоногих.

Животным и при заражении куриных эмбрионов вводят дефибринированную кровь или суспензию растертых на физиологическом растворе сгустков крови, биопсийного материала кожи, а также других тканей больного в зависимости от формы поражений.

При заражении клеточных культур используют плазму, гепаринизированную (или обработанную ЭДТА) кровь, биопсийный материал. Целесообразно выделение возбудителя не только от больного, но и из переносчиков (клещи, блохи, вши). Эффективно риккетсиологическое обследование снятых с человека переносчиков классическими (выделение возбудителя) и экспресс-методами (метод флюоресцирующих антител, ИФА, РНГА с иммуноглобулиновыми диагностикумами для выявления антигенов риккетсий групп СТ и КПЛ).

Для биопроб используют молодых, весом 300–350 г морских свинок-самцов. Заражение проводят внутрибрюшинным введением 3–5 мл крови или 10 %-ной суспензии материалов, содержащих риккетсий (сгустки крови и органы человека и животных, членистоногие), двум-трем животным. У животных ежедневно измеряют ректальную температуру. После инкубационного периода от нескольких дней до нескольких недель у морских свинок развиваются различные формы экспериментальных риккетсиозов (лихорадочные, лихорадочно-скротальные, бессимптомные). При заражении R. rickettsii, реже – О. tsutsugamushi и С. burnetii у морских свинок может возникать летальная инфекция. Наиболее характерным для риккетсиозов проявлением экспериментальной инфекции у морских свинок-самцов при внутрибрюшинном заражении является скротальный феномен – периорхит с накоплением риккетсий во влагалищных оболочках яичка. В ряде случаев может возникать специфический перитонит, риккетсии накапливаются в эндотелиальных клетках кровеносных сосудов различных органов и тканей (тестикулы, мозг, селезенка, надпочечники). Животных вскрывают на высоте лихорадки, одно из биопробных животных оставляют для серологического исследования (как правило, через 3–4 недели после заражения).

При всех формах инфекционного процесса у биопробных животных выявляют антитела к антигенам риккетсий в различных серологических реакциях (РА, РСК, РНИФ, ИФА). Используют цельнорастворимые и корпускулярные антигены из штаммов различных видов риккетсий. В большинстве серологических реакций отмечается выраженная перекрестная реактивность внутри групп (СТ и КПЛ). Для анализа антигенной структуры риккетсий чаще используют гипоиммунные сыворотки белых мышей и корпускулярные антигены.

Культивирование в желточных мешках развивающихся куриных эмбрионов более эффективно для накопления риккетсий по сравнению с биопробными животными. Однако первичное выделение штаммов риккетсий на куриных эмбрионах проводят редко в связи с высокой вероятностью контаминации посторонней микрофлорой, преимущественно для выделения гемокультур. Обычно куриные эмбрионы при выделении штаммов заражают пассажным материалом от зараженных лабораторных животных (чаще – суспензии тестикул, селезенок, головного мозга). При культивировании учитывают сроки гибели зараженных эмбрионов, видимые изменения (геморрагические поражения), интенсивность накопления риккетсий. Погибшие в течение 3 суток после заражения эмбрионы отбраковывают (неспецифические проявления, чаще – травматическая гибель). Развитие инфекции в клеточных культурах у различных видов родов Rickettsia и Orientia отличается. Для риккетсий Провачека и ориенций Цуцугамуши характерно накопление микроорганизмов в больших количествах в отдельных клетках. Дегенеративные изменения клеток вследствие перепроизводства возбудителя сопровождаются их разрывом и освобождением микроорганизмов с распространением инфекции на соседние клетки. Для группоспецифической идентификации риккетсий группы клещевых пятнистых лихорадок (КПЛ) можно использовать РСК с сыворотками крови биопробных морских свинок и цельнорастворимыми антигенами оригинальных штаммов риккетсий и музейных штаммов известных видов. Дифференциация риккетсий группы КПЛ ранее базировалась преимущественно на учете их токсических свойств, а также использовании корпускулярных антигенов и иммунных мышиных сывороток для идентификации риккетсий. Можно использовать метод флюоресцирующих антител с мазками-отпечатками желточных мешков куриных эмбрионов, ИФА и РНГА с иммуноглобулиновым диагностикумом для выявления риккетсий группы КПЛ и сыпного тифа.

Дальнейшая идентификация проводится в перекрестной РСК с сыворотками мышей чистых линий (СВА) и набором антигенов риккетсий. В РНИФ с моноклональными антителами к риккетсиям, а также с помощью генетических методов (рестрикционный анализ ДНК, ДНК-зондирование, полимеразная цепная реакция с использованием праймеров области гена цитратсинтазы и белкового антигена 190 кДа с последующим определением нуклеотидных последовательностей амплифицированных фрагментов ДНК и др.).

3. Изучение серологического метода диагностики риккетсиозов (составить схему и записать в тетрадь)

Реакцию Вейля-Феликса с протейными антигенами варианты реакции агглютинации со специфическими риккетсиальными антигенами в настоящее время практически не применяют в связи с недостаточной чувствительностью и специфичностью.

Существует более чувствительный метод микроагглютинации с меченными флюорохромом риккетсиями для серодиагностики риккетсиозов группы сыпного тифа (СТ), однако, не нашедший широкого применения в практике.

В течение многих десятилетий РСК являлась базовым методом серологической диагностики риккетсиозов. Метод обладает высокой групповой специфичностью даже при низких (1:10-1:20) разведениях сывороток, однако недостаточно чувствителен в ранней фазе заболевания.

Комплементсвязывающие антитела при большинстве риккетсиозов групп СТ и КПЛ выявляют в конце первой – начале второй недели инфекции, в некоторых случаях – в более поздние сроки. Наличие группоспецифического полисахаридного комплекса в составе препарата растворимого антигена для РСК приводит к отсутствию четкой видовой дифференциации внутри групп СТ и КПЛ, хотя титры антител обычно бывают выше к гомологичному антигену.

Группоспецифическая диагностика риккетсиозов группы КПЛ в РСК в России осуществляется с растворимым антигеном R. sibirica, в Америке – R. rickettsii, в Европе – R. conorii, что определяется распространением важнейших риккетсиозов этой группы – клещевого сыпного тифа Северной Азии, пятнистой лихорадки Скалистых гор и марсельской лихорадки соответственно. Более четкая видовая дифференциация внутри групп осуществляется с помощью корпускулярных антигенов, однако чаще не в РСК, а в РНИФ. Антигены и другие ингредиенты для РСК выпускают в Пермском филиале НПО «Микроген».

Реакцию непрямой гемагглютинации применяют для диагностики риккетсиозов как группы СТ, так и группы КПЛ. В качестве гемосенситина используют комплекс ЛПС и белковых антигенов. В нашей стране метод применяется преимущественно для выявления антител к риккетсиям группы СТ. Препарат выпускают в Пермском филиале НПО «Микроген». РНГА – наиболее ранний, чувствительный метод выявления текущей (острой) риккетсиозной инфекции, выявляет преимущественно IgM-антитела, быстроисчезающие после перенесения инфекции. Латекс-агглютинация в целом близка по своим параметрам к РНГА, используется как метод первичного тестирования сывороток крови, группоспецифична, выявляет как IgM-, так и IgG-антитела, в связи с высокой перекрестной реактивностью внутри группы СТ не позволяет дифференцировать эпидемический и эндемический сыпной тиф.

Иммуноферментный анализ применяют для серодиагностики риккетсиозов групп СТ и КПЛ, лихорадки Цуцугамуши. Применяют различные варианты ИФА с использованием ренографиночищенных антигенов для сенсибилизации планшет. По чувствительности и специфичности ИФА сопоставима с РНИФ, однако имеет некоторые преимущества для выявления антител в низких титрах (у вакцинированных, в период поздней реконвалесценции), что можно использовать при ретроспективном эпидемиологическом анализе. В России выпускают тест-системы ИФА для выявления антигенов коксиелл Бернета и антител к ним (Санкт-Петербургский НИИ ЭМ им. Пастера). В последние годы в Омском НИИ природно-очаговых инфекций разработан ИФА для выявления антител к риккетсиям группы КПЛ, показана эффективность применения ИФА с антигеном R. sibirica для диагностики клещевого риккетсиоза.

Реакция непрямой иммунофлюоресценции считается «золотым стандартом» серодиагностики риккетсиозов, используемым в большинстве лабораторий. Метод обладает высокой специфичностью и чувствительностью, воспроизводимостью, позволяет выявлять IgM- и IgG-антитела как вместе, так и раздельно в зависимости от применяемых конъюгатов. При риккетсиозах группы КПЛ и лихорадке Цуцугамуши диагностически значимые титры IgM-антител выявляют в конце первой недели, IgG-антител – в конце второй недели заболевания. В России корпускулярных антигенов для РНИФ не выпускают. Методом подтверждения стандартных серологических методов диагностики является иммуноблотт. Показано, что перекрестно-реагирующие антитела направлены против ЛПС и относятся к IgM-антителам, IgG-антитела образуются как к ЛПС, так и к белковым антигенам риккетсий. Коммерческие наборы для иммуноблотта находятся в стадии разработки.

Молекулярно-биологическиеметоды. Генетические методы находят все более широкое применение для изучения и идентификации риккетсий. Среди них используют анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ДНК (ПДРФ), метод геномной дактилоскопии (ДНК-зонды), анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов амплифицированной в полимеразной цепной реакции ДНК (ПДРФа ДНК ПЦР), пульсовый гелевый электрофорез, метод сравнения нуклеотидных последовательностей.

Рестрикционный анализ требует для своего осуществления большого количества ДНК, что на первых этапах генетического изучения риккетсий требовало накопления биомасс риккетсий на чувствительных моделях (желточные мешки куриных эмбрионов, культуры клеток). Использование методов, основанных на полимеразной цепной реакции, является более рациональным. При этом не только не требуется длительное культивирование микроорганизмов, но часто эти варианты генетического анализа оказываются более чувствительными и специфичными.

4. Изучение бактериологического метода выделения Coxiella burnetti (нарисовать схему диагностики)

Диагноз лихорадки Ку вследствие полиморфизма клиники невозможен без лабораторного подтверждения. Основной метод – РСК. Наряду с ним используют более чувствительные методы – РНИФ и ИФА. У больных преобладают антитела к антигену C. burnetii фазы 2; антитела к антигену фазы 1 преобладают при формировании хронического течения.

Возбудитель Ку-лихорадки выделяют из крови, мокроты, ликвора, грудного молока или мочи больных с использованием тканевых сред. Для постановки биологической пробы используют морских свинок, белых мышей и крыс. У морских свинок через 7 дней после заражения развивается лихорадка. Риккетсии Coxiella burnetti в большом количестве накапливаются в печени, селезенке и других органах. Иногда у морских свинок после заражения бывает бессимптомное течение инфекции, что заставляет прибегать к постановке серологических реакций с целью окончательной диагностики. Специфичность инфекции удается доказать иногда только через нескольких пассажей. Чистые культуры выделяют путем введения в желточный мешок куриных эмбрионов исследуемого материала.

5. Изучение серологических методов диагностики Ку-лихорадки (записать в тетрадь, оформить протокол)

Серодиагностика наиболее проста, доступна и не менее надежна. Обычно применяют реакцию связывания комплемента и реакцию агглютинации. В РСК с антигеном диагностический титр 1:8- 1:16 выявляется с 10–12-го дня болезни (с антигеном II фазы) и достигает максимального значения на 3–4-й неделе болезни (с антигеном I фазы). Комплементсвязывающие антитела в низких титрах выявляются у реконвалесцентов в течение ряда лет. Надежным методом диагностики является иммунолюминесцентный метод исследования. Для непосредственной и ретроспективной диагностики Ку-лихорадки предложена внутрикожная проба. Трудности приготовления стандартного антигена лишают ее практической ценности, хотя при эпидемиологических и эпизоотологических обследованиях эта проба могла бы быть полезной.

6. Знакомство с препаратами для специфической диагностики, профилактики и лечения риккетсиозов (записать в тетрадь)

Вакцина Е сыпнотифоз­ная, живая. Живые авирулентные риккетсии Провачека. Селекция авирулентного штаммма риккетсии Провачека. Профилакти­ка по эпидемическим показаниям. Создание ак­тивного имму­нитета.

Вакцина сып­нотифозная химическая. Содержит растворимый антиген (химический способ) из ви­рулентных риккетсии Провачека. Профилакти­ка по эпидемическим показаниям. Создание ак­тивного имму­нитета. Вакцина М-44 живая. Содержит аттенуированный (ослабление вирулентных штаммов) штамм С. Burneti. Используется для профилакти­ки по эпидемическим показаниям. Создание ак­тивного имму­нитета.