Методы выделения чистых культур

Под чистой культурой понимают потомство одной единственной клетки (клон). Для получения чистой культуры используют методы, основанные на изолировании отдельных клеток на твердой питательной среде. Однако получение отдельной колонии не всегда гарантирует чистоту культуры, поскольку колонии могут вырасти не только из отдельных клеток, но и из скоплений. Из чистой культуры обычно вырастают одинаковые колонии и при микроскопировании выявляются похожие клетки по размеру и окраске по Граму. Выделяют следующие методы:

1. Метод Коха. Засев петлей или тампоном частым штрихом по всей поверхности чашки с питательной средой.

2. Метод Дригальского. Исследуемый материал рассеивают в первую чашку, этим же шпателем, не прокаливая, рассевают на вторую чашку, затем также на третью.

3. Метод серийных разведений (качественный и количественный). Делают несколько последовательных десятикратных разведений материала (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000 и т.д.), высеивают с 2 или 3 пробирок на плотную питательную среду по 0,1 мм и распределяют шпателем.

4. Метод штриха («штрихованные чашки»). Чашки размечают на 3 сектора буквой Т:

1-й сектор – петлей зигзагом наносят штрихи; петлю прокалить, остудить.

2-й сектор – проводят петлей по поверхности среды в секторе 1 и штрихом сеют на сектор 2; петлю прокалить, остудить.

3-й сектор – проводят петлей по поверхности сектора 2 и сеют на сектор 3 штрихом.

5. Метод Гоулди (качественно-количественный). Позволяет не только выделить чистую культуру, но и определить количество бактерий в одном грамме твердых или в одном см³ жидких материалов (количество колониеобразующих единиц – КОЕ). Посев стерильной бактериологической петлей (4 мм) на:

1-й сектор – 30–40 штрихов, обжечь петлю.

2-й сектор – 4 штриха, обжечь петлю.

3-й сектор – 4 штриха, обжечь петлю.

4-й сектор – 4 штриха.

 

Определение численности бактерий представлено в следующей таблице:

 

Количество бактерий, выросших на секторе	Количество бактерий в 1 мл жидкости
1–6	Нет роста	Нет роста	Нет роста	1 000
8–20				1 000
21–30				5 000
31–60				10 000
70–80				50 000
100–150	5–10			100 000
Очень много колоний	20–30			500 000
То же	40–60			1 000 000
То же	100–140			5 000 000
	Очень большое количество	30–40		10 000 000
	То же	60–80	Единичные	50 000 000
	То же	80–140	От единичных до 25	100 000 000

Основные требования, предъявляемые к питательным средам:

а) оптимальное содержание питательных веществ, необходимых для жизнедеятельности изучаемых микроорганизмов;

б) соответствующее значение рН среды;

в) изотоничность;

г) влажность;

д) абсолютная стерильность.

Размножение микробов происходит при оптимальной температуре, обычно 37 °С, постоянство которой поддерживается в термостате; при доступе кислорода (аэробы) или в бескислородных условиях (анаэробы), в темноте.

Классификация питательных сред:

По консистенции: жидкие, полужидкие, плотные. Плотность создается добавлением к жидким средам 2–3 %-го агара (полисахарида, получаемого из морских водорослей), обладающего способностью растворяться в воде при 100 °С и застывать при комнатной температуре, создавая гель.

По происхождению: естественные, искусственные, синтетические.

Естественные среды готовят из овощей (картофель, морковь), молока, яиц, сыворотки крови и пр.

Искусственные включают переработанные естественные про-дукты (например, мясную воду, мясной перевар) и вещества, полученные из этих продуктов (пептон, дрожжевой и кукурузный экстракты и др.).

Синтетические создают из химически чистых соединений с точно известным составом (аминокислоты, углеводы, витамины, минеральные соли).

По целевому назначению: основные и специальные.

Специальные подразделяются на сложные (с повышенной питательной ценностью), элективные, дифференциально-диагно-стические.

Основные:

МПБ готовят на основе мясной воды (настоя измельченного мяса), к которому добавляют пептон, поваренную соль, и устанавливают нужное значение рН; МПА, плотность создают добавлением агара.

Сложные: с обогащением простых сред углеводами (сахарный бульон, сахарный агар с глюкозой) или белками (кровяной бульон или кровяной агар, сывороточный бульон или агар, асцит-бульон или асцит-агар).

Элективные,или избирательные среды, предназначены для культивирования определенных видов микроорганизмов, что создается различными способами. Примеры элективных сред:

а) среда Ру (свернутая, неразведенная сыворотка) или среда Леффлера (свернутая смесь 3 частей сыворотки и 1 части сахарного бульона) элективны для дифтерийной палочки, которая на этих средах опережает сопутствующие микробы по темпу роста;

б) щелочной агар, щелочная пептонная вода элективны для холерного вибриона, который быстро размножается, тогда как для других микробов рН 8,0–8,2 не является благоприятной;

в) солевой МПБ, солевой МПА элективны для стафиллококков, которые могут размножаться при содержании в среде до 20 %-го хлорида натрия, а другие микробы не выносят повышенной концентрации соли (оптимальная для большинства микробов – 0,5 %);

г) желчный бульон элективен для сальмонелл, размножение которых стимулирует добавленная 10 %-я желчь, одновременно тормозящая рост некоторых сопутствующих микробов;

д) селенитовая среда обогащения – для накопления патогенных энтеробактерий, в которой добавленный 10 %-й раствор однозамещенного кислого селенита натрия (NaHSeO₄) тормозит рост сопутствующих микробов, не мешая размножению шигелл, сальмонелл.

Дифференциально-диагностические среды – среды, предназначенные для дифференциации бактерий по их ферментативной активности.

Примеры: среды Эндо, Левина, Плоскирева, Гисса.

В состав ДДС входят следующие компоненты:

а) основная питательная среда;

б) определенный углевод (например, лактоза);

в) цветной индикатор.

Пример: среда Эндо позволяет дифференцировать лактозоположительные бактерии от лактозоотрицательных.

Лактоза + бактерии будут изменять цвет среды за счет сдвига pH в кислую среду вследствие ферментации лактозы.