Принцип метода. Белок образует окрашенный комплекс с ионами меди в щелочной среде.
Ход работы: В пробирках готовят следующие растворы (табл. 3):
Таблица 3.
| Компоненты проб | № пробирки | ||
| 1 (А 1) | 2 (А 2) | 3 (В) | |
| Сыв-ка крови человека зрелого возраста | 0,1 | - | - |
| Сыв-ка крови человека старого возраста | - | 0,1 | - |
| Стандартный р-р белка | - | - | 5,0 |
| Рабочий р-р | 5.0 | 5,0 | 5,0 |
Содержимое пробирок перемешивают, выдерживают при комнатной температуре 20-25 градусов в течение 30 минут. Оптическую плотность всех растворов измеряют при длине волны 540 нм., «ноль» устанавливают против контроля.
Концентрацию общего белка в сыв-ке крови вычисляют по формуле:
СОБ. = (ЕА1 / Ест ) * 70, где
СОБ.- концентрация общего белка в сыв-ке крови в г/л;
ЕА1,А2 – экстинция опытных проб;
70 – концентрация белка в стандарте в г/л.
Рекомендации по оформлению результатов работы и написанию выводов.
Оформить результаты работы в виде таблицы 4:
Таблица 4.
Результаты исследования концентрации об. белка в сыворотке крови практически здоровых людей зрелого и пожилого возраста
| № пробирки | |||
| Оптическая плотность | |||
| Значение концентрации общего белка (мМоль/л) |
В выводе сравнить между собой, а также с возрастными нормами из литературных источников численные значения концентрации общего белка в сыворотке крови людей зрелого и пожилого возраста, объяснить обнаруженные различия.
7. Контрольные вопросы по теме занятия (см. задание к занятию).
8. Литература для подготовки (см. задание к занятию).
9. Обсуждено на заседании кафедры 18. 04. 2011 г.
10. Учебное задание подготовлено проф. Мещаниновым В.Н., асс. Голомолзиным Б.В., студ. 2 курса Батыршиным Г.
ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия
Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
кафедра биохимии
Утверждаю
Зав. каф. проф., д.м.н.
Мещанинов В.Н.
_____‘’_____________2011 г
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
К ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗАНЯТИЮ № 32/2
(для студентов)
Факультеты: педиатрический
Курс: 2
1. Тема занятия: Биохимия молока и лактации.
2. Учебная цель занятия: Изучить нейроэндокринную регуляцию развития молочных желез и лактации; механизмы образования молока, химический состав и питательную ценность в различные сроки лактации.
3. Задачи занятия:
1. Ознакомиться со структурой, биохимической ролью и метаболизмом гормонов, регулирующих развитие и лактацию молочных желез.
2. Изучить в сравнительном аспекте физико-химические свойства, качественный и количественный химический состав, питательную ценность различных видов женского молока и зрелого коровьего.
3. Научиться определять в молоке содержание химических веществ, проводить специфическую реакцию Умикова с целью отличия женского молока от коровьего.
4. Продолжительность занятия: 3 акад. часа.
5. Задание студентам:
1. Получение осадка казеина и его открытие.
2. Открытие альбуминов и глобулинов в молоке биуретовой реакцией.
3. Отделение альбуминов и глобулинов.
4. Открытие в безказеиновом фильтрате молока кальция, неорганического фосфора, лактозы, аминокислот, витаминов А, В2.
5. Проведение специфической реакции Умикова.
6. Методические указания к выполнению самостоятельной работы на занятии.
Работа № 1. Осаждение казеиногена.
В пробирку отмеривают 2 мл 0,1 н СН3СООН и 2 мл 0,1 н CH3COONa. Полученный раствор представляет буферную смесь с рН=4,7, соответствующим изоэлектрической точке казеиногена. Добавляют в пробирку 20 капель молока, раствор взбалтывают, казеиноген выпадает в осадок. Через 5—7 минут жидкость отфильтровывают от осадка казеиногена через двойной бумажный фильтр. Если фильтрат получается мутным, повторяют фильтрование. Фильтрат и осадок казеиногена сохраняют для дальнейших исследований.
На фильтр с осадком казеиногена наливают 10—12 капель 0,1 н Na2CO3. Казеиноген растворяется в соде и раствор его проходит через фильтр. Открывают казеиноген в растворе биуретовой реакцией, прибавляя к нему 5 капель 10% NaOH и 2 капли 2% CuSО4.
Работа № 2. Отделение альбуминов и глобулинов.
К 1 мл фильтрата после осаждения казеиногена добавляют 1 мл насыщенного раствора сернокислого аммония и оставляют стоять 10 минут. Жидкость мутнеет вследствие выпадения в осадок глобулинов. Отфильтровывают осадок глобулинов через бумажный фильтр. К полученному фильтрату добавляют кристаллический сернокислый аммоний до полного насыщения— выпадает осадок альбуминов.
Работа № 3. Открытие кальция, фосфора, лактозы, аминокислот.
Открытие кальция. Отмеривают в пробирку 10 капель фильтрата после осаждения казеиногена и добавляют 10 капель раствора щавелевокислого аммония. Раствор мутнеет вследствие образования осадка щавелевокислого кальция.
Открытие фосфора. К 10 каплям фильтрата после осаждения казеиногена добавляют 5 капель раствора молибденово-кислого аммония, 5 капель 1% гидрохинона и через 5 минут 10 капель карбонатсульфита. Развивается синее окрашивание.
Открытие лактозы. Остаток фильтра после осаждения казеиногена нагревают в пробирке до кипения и в кипящую жидкость по каплям прибавляют 0,1 н Na2CO3 до полного осаждения (выпадения в виде хлопьев) альбуминов и глобулинов. Добавление Na2CO3 производят с целью довести реакцию среды до рН, соответствующего изоэлектрической точке этих белков. Жидкость охлаждают до комнатной температуры, осадок отфильтровывают через бумажный фильтр. Полученный фильтрат делят на 2 части. В одной из них открывают присутствие лактозы реакцией Фелинга. Для этого к фильтрату добавляют по 10 капель реактивов Фелинга I и II нагревают до кипения.
Открытие аминокислот. Ко второй части фильтрата добавляют 5 капель 0,1 н СН3СООН, 3 капли 1% водного раствора нингидрина и кипятят 1—2 минуты. Развивается фиолетовое окрашивание.
