Ћекции.ќрг


ѕоиск:




 атегории:

јстрономи€
Ѕиологи€
√еографи€
ƒругие €зыки
»нтернет
»нформатика
»стори€
 ультура
Ћитература
Ћогика
ћатематика
ћедицина
ћеханика
ќхрана труда
ѕедагогика
ѕолитика
ѕраво
ѕсихологи€
–елиги€
–иторика
—оциологи€
—порт
—троительство
“ехнологи€
“ранспорт
‘изика
‘илософи€
‘инансы
’ими€
Ёкологи€
Ёкономика
Ёлектроника

 

 

 

 


ћетод молекул€рной гибридизации




 

ћетод молекул€рной гибридизации (ƒЌ -гибридизаци€, ƒЌ -зонды) широко примен€етс€ дл€ диагностики инфекционных болезней, в генетике, криминалистике и т.д. ћетод основан на уникальном свойстве генетического материала организма Ц молекулы ƒЌ  Ц, состо€щей из мононуклеотидов, образовывать двойную спираль с комплементарно соединенными азотистыми основани€ми. »звестно, что молекула ƒЌ  представл€ет полимер, состо€щий из четырех видов дезоксирибонуклеотидов (dAMP, dGMP, dTMP, dCMP), соединенных между собой 3'- и 5'-фосфодиэфирными св€з€ми дезоксирибоз. ћолекула ƒЌ  образует двойную спираль, при которой азотистые основани€ первой цепи строго комплементарно соедин€ютс€ водородными св€з€ми с азотистыми основани€ми второй цепи, при этом аденин соедин€етс€ с тимином, гуанин с цитозином.

ѕринцип метода

—труктуру двойной спирали ƒЌ  (или –Ќ ), скрепленную водородными св€з€ми, можно разрушить нагреванием, поскольку спаренные, не св€занные между собой ковалентно, две полинуклеотидные цепи ƒЌ  после разрыва всех водородных св€зей полностью раздел€ютс€.

ѕроцесс разделени€ цепей называют денатурацией или плавлением ƒЌ . ƒенатураци€ происходит в узком интервале температур и сопровождаетс€ гиперхромным эффектом, т.е. при этом происходит возрастание поглощени€ ультрафиолетовых лучей. “емпературу, при которой происходит разделение цепей ƒЌ , называют точкой плавлени€ (“ пл.), котора€ в зависимости от состава ƒЌ  имеет величину примерно 85-95о C. ѕроцесс денатурации ƒЌ  обратимый, т.е. при снижении температуры происходит восстановление водородных св€зей Ц отжиг Ц образование двойной спирали. Ёто €вление называют ренатурацией (рис. 12.2.). –енатураци€ св€зана со специфичностью спаривани€ азотистых оснований между комплементарными цеп€ми. –еакци€ происходит в две стадии: вначале короткие комплементарные последовательности двух цепей случайно соедин€ютс€ друг с другом и образуют двухспиральный участок, затем образуетс€ длинна€ двухцепочечна€ структура с восстановлением первоначальных свойств, утраченных при денатурации.

¬ ренатурации участвуют две комплементарные последовательности. ≈сли при этом вз€ты цепочки молекулы ƒЌ  из различных источников, то говор€т о гибридизации, например при отжиге ƒЌ  и –Ќ .

¬ основе гибридизации лежит тот же принцип спаривани€ комплементарных оснований, который обеспечивает репликацию ƒЌ  или ренатурацию молекул. —пособность к гибридизации двух препаратов нуклеиновых кислот €вл€етс€ строгим тестом на комплементарность их последовательностей.

–ис. 12.2. —хема денатурации и ренатурации ƒЌ ; двойна€ спираль образуетс€ по принципу комплементарности азотистых оснований.

а) нативна€ молекула ƒЌ ,

б) денатурированна€ молекула ƒЌ ,

в) ренатурированна€ молекула ƒЌ .

—пособы гибридизации

√ибридизацию можно осуществл€ть в растворе или на фильтре (капроновом или нитроцеллюлозном). ѕри гибридизации молекул в растворе препараты (одноцепочечные молекулы) смешивают и определ€ют образование двухцепочечных молекул при отжиге по изменению гиперхромного эффекта или же по количеству метки в двухцепочечной ƒЌ  (дл€ этого один из препаратов ƒЌ  предварительно мет€т радиоактивным изотопом). ”добным дл€ работы €вл€етс€ метод гибридизации с использованием фильтров. ѕри этом один из препаратов ƒЌ  иммобилизуют на нитроцеллюлозных фильтрах, на которых молекула ƒЌ  адсорбируетс€. ‘ильтры с адсорбированной одноцепочечной ƒЌ  обрабатывают таким образом, чтобы предотвратить дальнейшую адсорбцию одноцепочечных молекул.

Ќа рис. 12.3. показана схема гибридизации на фильтре.

 

–ис. 12.3. —хема гибридизации на фильтре.

ј - иммобилизованна€ на фильтре одноцепочечна€ ƒЌ ;

Ѕ - одноцепочечна€ ƒЌ  в растворе;

¬ - фильтр с иммобилизованной одноцепочечной ƒЌ  опускаетс€ в раствор, содержащий денатурированную молекулу ƒЌ .

‘ильтр с адсорбированной ƒЌ  погружают в раствор, содержащий второй препарат денатурированной ƒЌ  (ƒЌ -зонд). —в€зывание ƒЌ -зонда происходит только в том случае, если он имеет комплементарную последовательность с первоначально адсорбированной на фильтре молекулой ƒЌ .

Ёффективность гибридизации определ€ют по количеству метки, оставшейс€ на фильтре. ћетод €вл€етс€ очень чувствительным и примен€етс€ дл€ изучени€ структуры гена. ѕри этом необходимо иметь меченые радиоактивным изотопом –Ќ  или ƒЌ -зонды, идентификаци€ которых с исследуемой молекулой регистрируетс€ с помощью радиоавтографии. ¬ качестве зонда используют клонированную кƒЌ -копию, т.е. меченую радиоактивным изотопом молекулу ƒЌ  с известной последовательностью нуклеотидов.

 





ѕоделитьс€ с друзь€ми:


ƒата добавлени€: 2016-11-02; ћы поможем в написании ваших работ!; просмотров: 9124 | Ќарушение авторских прав


ѕоиск на сайте:

Ћучшие изречени€:

Ќасто€ща€ ответственность бывает только личной. © ‘азиль »скандер
==> читать все изречени€...

446 - | 394 -


© 2015-2023 lektsii.org -  онтакты - ѕоследнее добавление

√ен: 0.013 с.