Реакция на тирозин (Миллона)

Принцип метода. При добавлении к раствору белка реактива Миллона (раствор ртути в азотной кислоте с небольшим количеством NaNO₂) при кипячении образуется кроваво-красный осадок ртутной соли динитротирозина, благодаря наличию в тирозине фенольного кольца. Химизм реакции можно предоставить следующим образом:

 

Следует избегать прибавления избытка реактива Миллона, так как он содержит азотную кислоту, которая, при взаимодействии с белком может дать желтое окрашивание, маскирующее реакцию Миллона.

Реактивы: раствор яичного белка; раствор фенола 0,1%; раствор желатина 1%; реактив Миллона (в 57 мл конц. азотной кислоты растворяют 40 г ртути сначала на холоде, а затем, нагревая на водяной бане; полученный раствор разбавляют 2 объемами воды, дают отстояться и сливают с осадка).

Ход работы: Берут три пробирки, в первую пробирку наливают 5 капель раствора яичного белка, во вторую — 5 капель раствора фенола, а в третью — 5 капель раствора желатина. В каждую пробирку приливают по 3 капли реактива Миллона и осторожно нагревают. В пробирке с яичным белком появляется кроваво-красное окрашивание, в пробирке с фенолом — розовато-красное, а в пробирке с желатином жидкость бесцветна, т.к. белки, не содержащие тирозина, этой реакции не дают.

 

Вопросы для самоконтроля.

1. Объясните принципы цветных реакций на белки и аминокислоты.

2. Как каждое из приведенных ниже полипептидов ведет себя при различных цветных реакциях на белок: треонил-аспарагил-лизил-тирозил-глутаминовая кислота и серил-цистеил-аланин?

3. Все ли пептиды дают положительную биуретовую реакцию?

4. Почему пролин дает с нингидрином желтую окраску?

5. Наблюдается ли положительная реакция Фоля в присутствии метионина? Почему?

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 2.

 

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ

 

Теоретическая часть.

Хроматографические методы применяют для сорбционно-динамического разделения смеси аминокислот, белков, липидов и их метаболитов. В зависимости от природы адсорбента и механизма разделения веществ хроматографию подразделяют на несколько видов:

адсорбционная — основана на различной способности отдельных компонентов смеси адсорбироваться на поверхности твердой фазы сорбента;

распределительная — основана на различной растворимости разделяемых веществ в двух малосмешивающихся жидкостях:

ионообменная — основана на различной способности разделяемых веществ к обмену их ионов на ионы неподвижной фазы сорбента;

осадочная — основана на образовании труднорастворимых осадков в определенной последовательности;

диффузионная — основана на разделении веществ по скорости диффузии внутрь сорбента в зависимости от размера молекул (гель-фильтрация).

Различают хроматографические методы анализа и по технике выполнения их: колоночная и плоскостная (на бумаге или в тонком слое). В зависимости от агрегатного состояния фаз хроматографию подразделяют на газовую, жидкостную и газожидкостную. Различаются виды хроматографии и по направлению движения растворителя (подвижной фазы): восходящая, нисходящая, одномерная, двухмерная и радиальная.

 

Практическая часть.